Viabilidade das células-tronco mesenquimais do tecido adiposo proveniente de lipoaspirado humano
Viability of mesenchymal stem cells of adipose tissue from human liposuction

INTRODUÇÃO

A lipoenxertia, técnica cirúrgica também nomeada como lipomodelagem ou lipofilling, vem se mostrando uma alternativa importante como adjuvante a técnicas de reconstrução mamária após tratamento cirúrgico de câncer de mama¹. Esse procedimento consiste na transferência de gordura autóloga para a mama, visando restituir o volume, assim como revitalizar e regenerar tecidos lesados por tratamentos adjuvantes como a radioterapia; ou mais recentemente descrito, para pequenos ajustes de volume em cirurgia conservadora para tratamento de câncer de mama^1,2. Esse potencial regenerativo deve-se às células-tronco derivada do tecido adiposo (CTDA), que estão presentes no tecido celular subcutâneo^1-4. Uma maneira prática de obtenção de área doadora de CTDAs, seguida do preparo para a injeção em área receptora, foi descrita na década de 90, por Coleman^3,4. Nessa técnica, a obtenção do lipoaspirado é realizada utilizando agulhas de 3mm de diâmetro acopladas em seringas de 10mL. Após, o conteúdo é centrifugado a 3000rpm durante 3 minutos^1,3,4. Na prática, existe uma grande variabilidade de métodos tanto para a obtenção do lipoaspirado, como na separação dos elementos que o compõem⁵.

As CTDAs provêm da mesma linhagem embriológica que as células-tronco da medula óssea. Tendo em vista a facilidade na obtenção cirúrgica, são consideradas uma fonte alternativa de células tronco^5-8. As CTDAs podem diferenciar-se além das células de origem mesenquimal (adipócitos, miócitos, condrócitos e osteócitos) em células não mesenquimais, como hepatócitos, neurônios, células pancreáticas, células endoteliais e cardiomiócitos^7,8.

A viabilidade das CTDAs pode estar relacionada a forma utilizada para a separação dos elementos do lipoaspirado^4,5,7. A identificação das condições de manejo que otimizem a viabilidade do conteúdo utilizado é importante para aprimorar a utilização da lipoenxertia como adjuvante na reconstrução mamária^8,9. Apesar de ser uma técnica amplamente usada, ainda existem questionamento sobre o efeito na viabilidade das CTDAs e dos adipócitos após a centrifugação; ou após a decantação do lipoaspirado^10,11.

OBJETIVOS

Diante disso, o presente estudo buscou avaliar a viabilidade celular das ASCs isoladas a partir de decantação e centrifugação em diferentes velocidades (500, 1000 e 3000rpm) e métodos de coleta: Coleman, lipoaspiração convencional assistida (LCAS) e associada ao VASER (Vibration Amplification of Sound Energy at Resonance).

MÉTODOS

Estudo clínico experimental foi realizado com amostras de lipoaspirados de tecido adiposo de pacientes maiores de 18 anos, que concordaram em participar da pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, e que foram submetidos aos procedimentos de lipoaspiração associado ou não à lipofilling, realizados em hospitais na cidade de Chapecó - Santa Catarina, entre junho e julho de 2018. Os pacientes foram escolhidos aleatoriamente, durante o período proposto para a coleta do material lipoaspirado.

Para verificar a influência do processamento de lipoaspirados por decantação ou centrifugação, foram avaliados cerca de 60mL de amostras residuais de cada paciente, subdivididas em 4 tubos Falcon^® de 15mL, sendo um submetido à decantação e cada um dos outros 3 tubos submetidos à centrifugação em velocidades diferentes de 500, 1000 e 3000rpm (equivalendo a 43, 173 e 1560g, respectivamente) (centrífuga com rotor: 11133 Buzzer, Sigma^®). Para análise da viabilidade celular, as ASCs foram tratadas com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Na amostra controle foi adicionada solução fisiológica 0,9% (SF 0,9%) na proporção 1:1, e mantida em decantação por 30 minutos¹². As demais amostras foram centrifugadas nas velocidades de 500, 1000 e 3000 rpm que equivalem respectivamente a 43, 173 e 1560g (considerando que 2g equivalem a 100 rpm na centrífuga com rotor: 11133 Buzzer, Sigma^®); durante 3 minutos. Em seguida, as amostras centrifugadas foram lavadas com SF 0,9% e centrifugadas novamente durante 10 minutos a 2000rpm. Adicionou-se a essas quatro amostras colagenase IA (C2674 - Sigma^®) na concentração de 0,075% na proporção 1:1 e incubou-se as amostras em banho-maria a 37ºC, durante 30 minutos, com homogeneização a cada 10 minutos^12,13. Para análise da viabilidade celular, as CTDAs foram tratadas com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).

O conteúdo do Falcon^® de 15mL, foram aspirados 200µL do fundo do pellet (porção inferior do tubo) e 200µL da região intermediária e encaminhadas para cultivo na placa de 12 poços, em triplicata, com adição de 2mL do meio DMEM (Vitrocell-Embriolife^®), contendo SFB 10%, anfotericina e penicilina. As amostras foram cultivadas em estufa sem CO2. Uma alíquota de cada amostra foi retirada e corada com corante Giemsa para avaliar a morfologia das células em microscopia óptica. Após 24 horas do cultivo celular, as células foram submetidas ao ensaio de viabilidade celular por brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). As placas de foram centrifugadas em 2500rpm por 15 minutos em centrífuga thermo-shaker (Agimaxx^®). Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 90µL de SF 0,9% a 37ºC e 10µL de reagente MTT. Incubou-se em banho-seco a 37ºC por 60 minutos. Centrifugou-se novamente em 2500rpm por 15 minutos e após descartou-se 70µL de cada amostra e adicionou-se 70µL de dimetilsufóxido (DMSO). Incubou-se por 10 minutos, repetiu-se a centrifugação nas mesmas condições e realizou-se a leitura em espectrofotometria de 560ηm^12,14.

Os dados de cultivo celular de células mesenquimais realizado pela técnica MTT foram analisados estatisticamente utilizando os procedimentos MEANS e UNIVARIATE e, pela análise de variância, utilizando o procedimento do software estatístico SAS^® (SAS INSTITUTE, 2002). Com a leitura das placas, os dados foram analisados utilizando o teste ANOVA, realizado pelo procedimento NPAR1WAY; e para comparação entre as médias encontradas adotou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, calculado no software SAS^®/Graphpad Prism 6.0^®. Os resultados de todas as análises foram considerados significativos com p<0,05. Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Unochapecó, sob Certificado de Apresentação para Apreciação Ética (CAAE) 73059017.4.0000.0116 e o parecer número 2.576.847.

RESULTADOS

Durante o período determinado para a coletada dos lipoaspirados, foi possível avaliar 24 amostras provenientes de seis pacientes (sendo cinco do sexo feminino e um do masculino), apresentando mediana de idade de 43 anos. A escolha de que os lipoaspirados fossem de diferentes técnicas foi para verificar se havia influência da metodologia de coleta (Coleman, lipoaspiração convencional assistida por sucção e VASER) de acordo com a maneira de separação dos componentes do lipoaspirado. A taxa de viabilidade celular foi consideravelmente maior nas amostras submetidas a centrifugações mais intensas. As amostras que passaram pela centrifugação a 3000rpm apresentaram melhores resultados quanto a viabilidade celular nas CTDAs submetidas ao ensaio com MTT (0,309±0,08A). Lipoaspirados centrifugados com 500 e 1000rpm mostraram taxas de viabilidades das CTDAs relativamente próximas (0,246±0,12B e 0,253±0,08B, respectivamente). Enquanto que a amostra lavada com SF 0,9% e decantada por 30 minutos, seguida da exposição ao MTT apresentou a menor taxa de viabilidade das CTDAs (0,219±0,18AB) (Figura 1).

Figura 1 - Viabilidade celular das amostras decantadas ou centrifugadas em 500, 1000 e 3000 rpm e submetidas a ensaio com MTT (n=6). Estudo ANOVA não paramétrico, das amostras em triplicata, no qual colunas correspondem à média encontrada e barras ao desvio padrão.

Figura 1 - Viabilidade celular das amostras decantadas ou centrifugadas em 500, 1000 e 3000 rpm e submetidas a ensaio com MTT (n=6). Estudo ANOVA não paramétrico, das amostras em triplicata, no qual colunas correspondem à média encontrada e barras ao desvio padrão.

Ao término do cultivo celular, as amostras coradas com corante de Giemsa e observadas em microscopia óptica mostraram morfologias semelhantes; não foram observados cariorrexe, quantidade significativa de células binucleadas e nem indícios de fragmentação de DNA nas diferentes amostras (Figura 2).

Figura 2 - Aspecto histomorfológico de amostras celulares dos lipoaspirados submetidos a decantação ou centrifugação em diferentes velocidades; e coradas por Giemsa. Decantação visualizada em 400X.

Figura 2 - Aspecto histomorfológico de amostras celulares dos lipoaspirados submetidos a decantação ou centrifugação em diferentes velocidades; e coradas por Giemsa. Decantação visualizada em 400X.

DISCUSSÃO

A viabilidade das células adiposas pode estar relacionada a diversos fatores: características do tecido adiposo do paciente; procedimento de extração; metodologia de centrifugação; forma de injeção do lipoaspirado; uso de soluções anestésicas; topografia da área doadora; entre outros^10,11,15. Não há um consenso de qual seria a maneira mais eficaz de processar a gordura (após a aspiração das áreas doadoras), para uma melhor viabilidade do enxerto; pois vários fatores podem influenciar na viabilidade das células que compõem o lipoaspirado^5,16,17.

Para esta pesquisa, optou-se por incluir amostras provenientes de diferentes técnicas de lipoaspiração pois o objetivo era avaliar o impacto da velocidade de centrifugação sobre a viabilidade celular, independentemente da técnica empregada na coleta. Em estudo realizado com resíduos de lipoaspirado, provenientes de três técnicas diferentes de obtenção das células adiposas, foi verificado que a LCAS é a que fornece menor quantidade de CTDAs¹⁸. Por outro lado, um estudo in vivo, em que sítios de coleta foram tratadas com VASER, os autores concluíram que resultados semelhantes foram encontrados na LCAS considerando a qualidade de retenção de células adiposas⁵. Em outro estudo experimental, que comparou a técnica de coleta de tecido adiposo por LCAS e a técnica Coleman, foi verificado que a técnica da aspiração com seringa preservaria a estrutura histológica dos adipócitos melhor do que a LCAS¹⁷.

O processo da centrifugação possibilita concentrar a gordura e fornece um número de células maior por mililitro; além de separar da gordura liquefeita e dos componentes celulares sanguíneos¹⁹. Foi relatado que as CTDAs presentes no pellet (após a lavagem do centrifugado) teriam maior viabilidade por não haver contaminantes dos restos da células sanguíneas, o que seria uma constante em amostras submetidas somente à decantação¹⁰. Centrifugação com velocidades e tempo de processamento menores, podem apresentar a mesma capacidade de compactação de células quando comparadas com velocidades e tempos maiores^20,21. Em nosso estudo, a amostra que foi submetida somente à decantação e as que foram centrifugadas em velocidades de 500 rpm (43g) e 1000 rpm (173g) apresentaram valores de viabilidade celular reduzida em relação à amostra de 3000 rpm. O fato de que as amostras submetidas à centrifugação em velocidades menores (500 e 1000 rpm) apresentaram resultados semelhantes, sugere que algum fator como restos celulares sanguíneos possam ter interferido na capacidade de reprodução celular. Isso foi um limitador apresentado durante a realização da pesquisa; pois, com a metodologia estabelecida, não foi possível identificar a causa específica relacionada com a menor viabilidade celular nas amostras que não foram centrifugadas em velocidade de 3000 rpm.

Considerando a variável morfologia celular, em estudo experimental não foram observadas alterações celulares em exame de microscopia óptica na centrifugação de 3600 rpm por 10 segundos⁹. Em outro experimento realizado com resíduos de lipoaspirado, de oito pacientes, centrifugados nas velocidades (400g, 700g, 1200g, 3000g ou 4200g) também não houve alteração da morfologia microscópica das células¹⁶. Enquanto que em outro trabalho, com metodologia semelhante, e usando as velocidades de centrifugação de 1500 e 3000rpm por 3 minutos, não foram descritas alterações em membrana celular, incluindo a amostra controle (decantação)¹⁵.

No presente estudo, após o cultivo feito por 24 horas, foi possível analisar a morfologia das amostras celulares coradas com Giemsa e não foram observadas alterações morfológicas entre as amostras decantadas e centrifugadas em diferentes velocidades, mas a viabilidade celular avaliada pelo método MTT, foi maior na amostra centrifugada a 3000rpm por 3 minutos. Esses achados sugerem que tanto a decantação, como as velocidades de centrifugação menores que 3000rpm, podem não interferir no aspecto microscópico das células, porém a velocidade maior teria uma relação com a manutenção da capacidade de multiplicação celular.

Por outro lado, em estudos experimentais que utilizaram cultivo celular em ratos, houve associação de efeitos deletérios em amostras celulares submetidas a velocidades maiores quando comparadas com as submetidas a centrifugações com velocidades menores^9,16. Essa diferença de resultados pode estar relacionada com a forma de metodologia do cultivo celular onde a maioria dos trabalhos que associaram melhor viabilidade celular com maiores velocidades de centrifugação, como no presente artigo, utilizaram cultura celular em placas, enquanto que os demais pesquisadores utilizaram modelo murino.

CONCLUSÃO

A lipoenxertia é de ampla aplicabilidade, especialmente na reconstrução de mama, cujo efeito estético e terapêutico são importantes para autoestima da paciente; o que pode contribuir com a qualidade de vida durante o tratamento. Visando o aprimoramento da técnica, são realizados estudos com as ASCs, principais responsáveis pelo potencial reconstrutor. Nesse contexto, foi possível verificar no presente estudo, que centrifugações com 3000rpm por três minutos resulta em manutenção de características biológicas das células mesenquimais de tecido adiposo; necessárias para a colonização celular nas áreas receptoras de enxerto. Isso reforça a aplicabilidade da técnica de Coleman, que pode ser realizada, em serviços de tratamento cirúrgico para o câncer de mama, desde que o cirurgião esteja habituado com a metodologia.