INTRODUÇÃO
Implantes mamários são rotineiramente utilizados em cirurgia plástica de mama estética
e reparadora, segundo a Sociedade Americana de Cirurgia Plástica, em 2016, 290.467
implantes para fins estéticos e 109.256 implantes para procedimentos reparadores1. Embora bastante utilizado, há risco de contratura capsular em 10,6% dos casos operados2. Porém, ao se realizar cirurgia reparadora, como reconstrução mamária, várias pacientes
deverão se submeter à radioterapia, como tratamento local do câncer de mama, nesses
casos a prevalência dessa complicação é maior do que 40% e a necessidade de retirada
da prótese é de 15%2.
Quando materiais inertes, como silicone, são implantados no corpo humano, o organismo
forma uma cápsula de tecido conectivo em volta do implante para isolá-lo dos tecidos
adjacentes. Em alguns casos devido a trauma, infecção e outras causas desconhecidas
esse invólucro torna-se fibrótico (contratura capsular). Dependendo do grau de fibrose
pode causar deformidade estética, dor e inflamação do local do implante3. Quando houver o encapsulamento da prótese, o tratamento deve ser cirúrgico com a
retirada da prótese e substituição por outra prótese em outro plano anatômico, por
exemplo, se a prótese for colocada acima do músculo peitoral e houver contratura,
a mesma deve ser substituída por outra prótese implantada abaixo do músculo. Esse
procedimento tem o objetivo de evitar recidiva da contratura4,5.
Por esse motivo, várias técnicas foram estudadas com o intuito de prevenir a ocorrência
de contratura capsular como o emprego de implantes texturizados, implante da prótese
em loja submuscular4, uso de medicamentos como corticoides, ciclosporina5 e antileucotrienos6,7. Todas essas alternativas terapêuticas demonstraram resultados variáveis, sem compor
evidência clínica.
Bastos et al. (2012)8, mostraram resultados positivos do uso de Montelukast, um antagonista de receptores
de leucotrienos, na prevenção de contratura capsular.
OBJETIVO
Este estudo analisará o efeito do Montelukast em modelos animais de contratura capsular
radioinduzida. Portanto, este trabalho teve como objetivo analisar o efeito de droga
antileucotrieno (Montelukast®) na formação de contratura capsular em ratos com implante de silicone que se submeteram
à radioterapia no intervalo de dois meses.
MÉTODOS
Foram analisadas 20 ratas Wistar, com peso variando entre 250-300g. Todos os animais
foram mantidos em biotério com temperatura controlada entre 22-23ºC, ciclo dia/noite
de 12.12h, água e alimento ad libitum. Este estudo seguiu as regras nacionais de padronização
de estudos em animais de laboratório (CONCEA) e foi aprovado pelo comitê de ética
de uso de animal da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CEUA-FMUSP)
sob registro 067/2017.
Procedimento cirúrgico
Os animais foram anestesiados por uma solução composta de 100mg/kg de peso de cloridrato
de quetamina (Ketamin®, Cristália, Brazil) e 10mg/kg de peso de cloridrato de xylazina (Rompun®, Bayer, Brazil) por via intraperitoneal.
Após anestesia intraperitoneal, os animais foram posicionados em decúbito ventral.
A seguir foi realizada tricotomia em uma área de 6cm2 na região da linha média da coluna logo abaixo das escápulas. Foi utilizado clorexidina
tópico para antissepsia dessa região.
Foi realizado, através do uso de bisturi lâmina 15, incisão de 2cm horizontal. Dissecção
de loja de 6cm2 abaixo do plano do panículo carnoso do animal e hemostasia com bisturi elétrico.
Antes de realizar o fechamento da loja foi implantando bloco de silicone de 2x2cm.
E a seguir os animais foram randomizados em dois grupos: controle (n=10), injeção
tissular ao redor do bloco de silicone utilizando 1ml de soro fisiológico 0,09%; grupo
antileucotrieno (n=10), injeção tissular ao redor do bloco de silicone utilizando
1ml de antileucotrieno (Singulair®, Merck Sharp & Dohme, Campinas, Brasil) diluído em soro fisiológico 0,9%.
Radioterapia
Todos os animais foram submetidos no pós-operatório imediato a uma sessão de radioterapia.
A radiação foi efetuada irradiador específico para animais de pequeno porte (Rad Source
RS2000, Quastar™), com raio-X de 160KV de 25mAs.
Os animais foram posicionados em decúbito lateral contidos por um imobilizador que
possibilitasse a emissão dos raios no plano tangencial como utilizado em pacientes.
Ainda foi inserido uma placa de chumbo de 5mm que possuía uma janela para a irradiação
do animal garantindo o tratamento apenas na região desejada. Foi utilizada dose única
de 10Gy em dois campos opostos (5Gy por campo), com carda de 6Gy/min.
Análise histológica
Após dois meses os animais foram eutanasiados por injeção intraperitoneal de cloridrato
de quetamina (Ketamin®, Cristália, Brazil) na dose de 180mg/kg de peso, associada à xylazina (Rompun®, Bayer, Brazil) na dose de 15mg/kg e, a seguir, colocados em câmara de CO a 100%.
Foram coletadas amostras da cápsula ao redor do bloco de silicone através de uma incisão
no dorso dos animais. Parte das amostras foram fixadas com formalina 4% por 24h e
a seguir coradas com hematoxilina-eosina (HE) e picrosirius para análise sob microscopia
(Nikon eclipse E600®, Japan) na magnificação de 200 e 400 vezes.
As lâminas coradas por hematoxilina-eosina analisaram a presença de células inflamatórias
e densidade vascular (contagem de arteríolas) em 10 campos ao longo dos cortes histológicos.
As lâminas coradas pelo método de picrosirius demonstraram graficamente a deposição
de colágeno ao longo da cápsula ao redor do bloco de silicone.
Análise da expressão gênica
Extração de RNA total
As amostras de panículo carnoso foram maceradas com o uso do aparelho Tissue Lyser
LT (Qiagen, Germantown, EUA). Aos tubos de microcentrífuga com as amostras adicionou-se
1,0ml de trizol® (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, EUA) e esferas de aço inoxidável. A fragmentação
foi realizada por 6 minutos a 50Hz.
Após a retirada das esferas, adicionou-se 0,2ml de clorofórmio (Merck). As amostras
foram centrifugadas por 15 minutos a 12.000rpm a 4ºC. Após a centrifugação, a fase
aquosa foi transferida para novo tubo de microcentrífuga e adicionou-se 0,5ml de álcool
isopropílico gelado (Merck) para precipitação do RNA. As amostras foram incubadas
à temperatura ambiente por 10 minutos e depois centrifugadas a 12.000rpm por 10 minutos
a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de RNA lavado com 1,0ml de etanol
75%. Centrifugou-se por 5 minutos a 10.000rpm a 4ºC. O pellet de RNA foi ressuspendido
em 50 a 100µL de água ultrapura estéril livre de DNase/RNase (Invitrogen-Life Technologies,
Carlsbad, EUA).
Determinou-se a concentração dos RNAs extraídos em espectrofotômetro NanoDrop(tm)
ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, EUA). O grau de pureza foi avaliado
pela relação 260/280nm, sendo utilizados apenas os RNAs cuja relação foi ≥1,8. Para
a análise da integridade dos RNAs, realizou-se eletroforese em gel de agarose para
verificação das bandas 28S e 18S. Os RNAs extraídos foram armazenados a -80ºC até
o uso.
Síntese de cDNA
Para a síntese de cDNA, a partir do RNA total, foi utilizado o kit High Capacity RNA-to-cDNA
(Applied Biosystems) em termociclador GeneAmp 2400 (Applied Biosystems). Em volume
final de 20µL: 1,0µL de enzyme mix; 10,0µL de RT buffer; qsp 20µL de água ultrapura
estéril livre de DNase/RNase e RNA total (500ng). Para a reação e parada da reação,
os tubos foram incubados a 37ºC por 60 minutos e a 95ºC por 5 minutos, respectivamente.
As amostras de cDNA foram armazenadas a -20ºC até o uso. Reação em cadeia da polimerase
em tempo real (qRT-PCR)
A análise da expressão dos níveis de mRNA dos genes de interesse foi realizada por
qRT-PCR no termociclador StepOnePlusTM (Applied Biosystems) com o sistema TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems).
As sondas e os primers para os genes C5AR1 (Rn02134203), ICAM 1 (Rn 00564227), NOS2
(Rn 00561646), VEGF (Rn 01511602) e para o controle endógeno ACTB (Rn 00667869) foram
adquiridas da lista de ensaios inventariados da empresa Applied Biosystems.
A qRT-PCR foi realizada em duplicata para cada amostra utilizando-se: 10,0µL TaqMan®
Universal Master Mix II 2X; 1µL TaqMan® Gene Expression Assay 20X e 4µL de cDNA diluído
(diluição 1:5) em volume final de 20µL, em placas de 96 poços cobertas com selante
óptico.
As condições de reação foram 50ºC por 2 minutos, 95 por 10 minutos, seguidos de 40
ciclos a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto.
Para o cálculo do nível de expressão de cada gene alvo, utilizou-se o software GenEx
Standard 6.1 (MultiD Analyses AB), que utiliza o método 2-delta delta Ct para a quantificação
relativa, onde Ct (threshold cycle) é o ciclo da PCR em tempo real, no qual a amplificação
atinge a fase logarítmica, onde delta Ct é a diferença de expressão entre gene alvo
e controle endógeno de uma determinada amostra, e delta delta Ct corresponde à diferença
entre o delta Ct da amostra e o delta Ct do controle.
Análise estatística
As variáveis foram submetidas à análise descritiva. Após a verificação da distribuição
e variâncias dos dados os dois grupos foram comparados utilizando-se teste Wilcoxon
rank sum (distribuição não normal), considerando-se p de alfa de 0.05. Foi utilizado
programa STATA versão 14 (StataCorp., 2015. Stata Statistical Software: Release 14.
College Station, TX: StataCorp LP, EUA).
RESULTADOS
Três animais no grupo controle e um animal no grupo AL apresentaram, deiscência e
extrusão do bloco de silicone após quatro semanas da irradiação.
Análise histológica
A análise pelo método de histomorfometria não demonstrou diferença quanto ao número
de células inflamatórias. Porém, houve diminuição da densidade vascular no grupo tratado
com AL ao se comparar com o grupo controle (55,4±30,0 (AL) vs. 81,8±26,7 (controle);
p=0.05) (Tabela 1 e Figura 1).
Tabela 1 - Análise pelo método de histomorfometria referente às células inflamatórias e densidade
vascular no grupo controle e no grupo AL.
| |
Controle (n=7) (média±DP) |
Antileucotrieno (n=9) (média±DP) |
| Células inflamatórias |
8,25±5,9 |
4,4±4,0 |
| Densidade vascular |
81,8±26,7 |
55,4±30,0 |
Tabela 1 - Análise pelo método de histomorfometria referente às células inflamatórias e densidade
vascular no grupo controle e no grupo AL.
Figura 1 - Lâminas coradas pelo método de HE, amostras por grupos. As setas azuis correspondem
a arteríolas ao longo da cápsula.
Figura 1 - Lâminas coradas pelo método de HE, amostras por grupos. As setas azuis correspondem
a arteríolas ao longo da cápsula.
As lâminas coradas por picrosirius demonstraram maior quantidade de colágeno no grupo
controle (Figura 2).
Figura 2 - Coloração de picrosirius evidenciou densidade de fibras de colágeno no grupo controle
ao se comparar com o grupo AL.
Figura 2 - Coloração de picrosirius evidenciou densidade de fibras de colágeno no grupo controle
ao se comparar com o grupo AL.
Análise da expressão gênica de biomarcadores (iNOS, VEGF-a, MMP-9)
O grupo AL mostrou menor quantidade de VEGF-a ao se comparar com o grupo controle
(0,02±0,001 vs. 0,34±0,1, respectivamente, p=0.04) (Tabela 2).
Tabela 2 - Expressão gênica de iNos, VEGF-a, ICAM-1 e MMP-9 nos grupos controle e AL.
| |
Controle (n=7) (média±DP) |
Antileucotrieno (n=9) (média±DP) |
| iNOS |
0,013±0,01 |
0,005±0,001 |
| VEGF-a |
0,34±0,1 |
0,02±0,001 |
| MMP-9 |
0,36±0,2 |
0,30±0,1 |
Tabela 2 - Expressão gênica de iNos, VEGF-a, ICAM-1 e MMP-9 nos grupos controle e AL.
DISCUSSÃO
Leucotrienos são lipídeos (eicosanoide) pertencentes à família de substâncias mediadoras
da inflamação. Agem na contração de músculo liso (broncoconstrição), além de aumentar
a permeabilidade microvascular perpetuando a reação inflamatória9.
Os antileucotrienos, portanto, tem como função diminuir e prevenir a contração da
musculatura lisa e diminuir a permeabilidade vascular. Embora o mecanismo de ação
ainda não esteja elucidado, vários estudos demonstraram o efeito benéfico dos antileucotrienos
em inibir ou minimizar a contratura capsular após implantes aloplásticos mamários6-8,10.
Nossa hipótese foi analisar o efeito de Al sobre a reação inflamatória local (diminuição
de neoangiogênese tardia e diminuição de células inflamatórias), bem como a inibição
da formação de fibrose. Para potencializar os resultados deste estudo e para mimetizar
situação clínica de tratamento adjuvante à reconstrução de câncer de mama, todos os
animais receberam uma dose de irradiação imediatamente após a cirurgia.
Este estudo demonstrou diminuição de 50% da contagem de células inflamatórias no grupo
Al (4,4±4,0) ao se comparar com o grupo controle (8,25±5,9). Embora não tenha alcançado
significância, há uma tendência a se observar menor reação inflamatória do grupo AL.
Já na análise histológica quanto a densidade vascular, este estudo demonstrou menor
contagem de vasos neoformados no grupo AL ao se comprar com o grupo controle (55,4±30,0
vs. 81,8±26,7, respectivamente; p=0.05). Esses dois achados sugerem diminuição da
inflamação crônica na cápsula do implante de silicone. Kang et al. (2015)11 analisaram o uso de Zafirlukast na formação de cápsula de implante de silicone em
coelhos. Esses autores demonstraram resultado semelhante ao nosso estudo, animais
tratados com Al apresentaram diminuição da contratura capsular após dois meses de
seguimento. Ainda Kang et al. (2015)11, também analisaram a reação inflamatória ao redor do implante de silicone. Novamente,
esse grupo demonstrou diminuição de macrófagos, como apresentado no nosso estudo.
Ainda, Kang et al. (2015)11, estudaram um desfecho intermediário aferindo a expressão gênica de miofibroblastos.
Os autores demostraram diminuição na expressão do gene dos miofibroblastos no grupo
tratado com AL em comparação com o grupo controle. Baseado nesses achados de literatura,
nosso grupo explorou outras vias responsáveis pelo mecanismo de ação de AL.
A expressão do gene iNOS foi maior no grupo controle do que no grupo AL (0,013±0,01
e 0,005±0,001, respectivamente) (p=0,08); mas, neste estudo, essa diferença apresentou
uma tendência à significância. A ação de óxido nítrico sintetase induzível (iNOS)
se refere a uma enzima na resposta inflamatória mediada por macrófagos. E, consequentemente,
o aumento de óxido nítrico (NO) produzido por macrófagos induz um estado pró-inflamatório.
Portanto, a diminuição da expressão gênica no grupo AL sugere um efeito anti-inflamatório
na cápsula do implante de silicone. Conforme demonstrado por McNeill et al. (2015)12. Segundo esse estudo, a deleção de macrófagos, segundo a via radicais livres, demonstrou
diminuição do processo inflamatório devido à inibição de iNOS11,12.
Outro biomarcador estudado por McNeill et al. (2015)12, foi VEFG-a como possível fator que contribuiria ao mecanismo de ação ao efeito anti-inflamatório
de AL. Em nosso estudo, a expressão gênica de VEGF-a diminuiu no grupo tratado com
AL ao se comparar com o grupo controle. Refletindo sobre esse desfecho, a diminuição
do marcador de neoangiogênese a longo prazo (2 meses) pode demonstrar a transição
de macrófagos fenótipo 1 para fenótipo 2, isto é, há resolução do processo inflamatório13. Outro desfecho intermediário analisado neste estudo, foi a expressão gênica de MMP-9,
que corresponde ao metabolismo de gelatinase (componente da matriz extracelular).
Vários autores já analisaram outras metaloproteinases, com o objetivo de se estudar
o metabolismo de colágeno na regeneração tissular14,15.
Este estudo não encontrou diferença na gelatinase (MMP-9) entre os grupos. Contudo,
este estudo apresentou algumas limitações: a estrutura anatômica do modelo murinho
adotado neste estudo apresentou algumas diferenças (panniculus carnosum) em relação
ao ser humano.
CONCLUSÃO
Este estudo sugere que AL tratamento com AL diminui a angiogênese em animais submetidos
a implantes de silicone e submetidos à radioterapia
Agradecimentos
Este estudo não seria possível sem a colaboração da Sra. Silvana Aparecida Biagion,
Sra. Edna Maria Rodrigues dos Santos, Sra. Roqueline Alves Lago e Sr. Bruno Valério
do Rosário.
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1. Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
Autor correspondente: Cristina Pires Camargos, Avenida Brigadeiro Luis Antonio, nº 4161 - Jardim Paulista, São Paulo, SP, Brasil,
CEP 01402-002. E-mail: cristinacamargo@usp.br
Artigo submetido: 02/11/2020.
Artigo aceito: 19/04/2021.
Conflitos de interesse: não há.
