ISSN Online: 2177-1235 | ISSN Print: 1983-5175

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Articles - Year1998 - Volume13 - Issue 1

RESUMO

A pesquisa consistiu em analisar o transplante livre de tecido adiposo autóloqo, em coelhos, obtido por 5 difirentes modalidades de colheita e preparo, a saber: aspirado, corte, dissecado, tratado e lavado. Nas duas primeiras modalidades, o tecido adiposo autólogo foi colhido por sucção. O aspirado (A) foi colhido com cânula de orifícios de bordas rombas e o corte (C) de bordas afiadas. As três demais modalidades de tecido adiposo foram obtidas por dissecção a céu aberto e fragmentação com tesoura delicada. O tecido assim colhido, fragmentado e injetado chamou-se dissecado (D). O tratado (T) recebeu adição de 2ml de meio de cultura de células 199 com sais de Earle. O lavado (L) foi submetido a lavagem com Ringer-lactato. As áreas doadoras do tecido adiposo foram as bolsas subcutâneas interescapulares. As orelhas dos coelhos foram as receptoras. Os animais foram sacrificados com 7 dias (9 animais) 180 (8 animais) e 360 dias (8 animais). Todas as áreas de transplante foram seccionadas transversalmente a cada 1 cm. A superfície de secção foi medida em sistema integrado para análise de imagem e cálculo do volume. Os cortes histopatolágicos foram quantificadas em: adipócitos, estroma, regiões císticas e inflamação. O volume percentual de adipócitos remanescentes nas 5 modalidades revelou aos 360 dias: Aspirado - 13,9%; Corte - 34,6%; Dissecado - 45,2%; Tratado - 27,0%; Lavado - 16,4%, com p = 0,003.

Palavras-chave: tecido adiposo; transplante autólogo; cirurgia plástica

ABSTRACT

The aim of this study was to assess the fate of autologous fat tissue grafts harvested and processed by five different methods: blunt suction, sharp suction, dissection, treatment, and lavage. Fat was harvested from the subcutaneous tissue of the interscapular region in 25 rabits and injected into the subcutaneous area of the convex surface of the ear. Harvesting was by either open surgical excision. Where open surgical excision was used, the frgmants were cut into smaller pieces with scissors. Suction in the blunt and sharp suction groups was performed using cannulas with blunt or sharp edged suction holes, respectively. In both suction groups, the harvested tissue was injected without further processing. In the treatment group, 2 ml of cell 199 culture medium and Earle's basic salt solution were added, and in the lavage group the tissue was washed with Ringer's lactate. Animals were killed at 7 (n=9), 180 (n=8), and 360 (n=8) days. Serial cross sections were taken From each recipient area and the specimens processed for histology. The images from each section were digitalized in a computer and, with the assistence of image analysis softwere, the volume of remaining fat cells was calculated for each recipient area. The percentage volumes of fat cells found in each group at 360 days were: blunt suction 14,0%, sharp suction 35%, dissection 45%, treatment 27%, and lavage 16% (p=0.003).

Keywords: transplantation; graft; adipose tissue; graft survival; tissue survival.


INTRODUÇÃO

A lipoaspiração fez renascer o interesse pelo enxerto de tecido adiposo autólogo (12), seguindo-se de opiniões controvertidas.

A enxertia, com aparente simplicidade de transferência, apresenta variações de: técnicas de colheita, manuseio, tratamento, forma de injetar, tecido receptor, índice de absorção, etc.

Há grande dificuldade em estudos clínicos para se comparar resultados através das fotografias de pré e pós-operatório (7). Os estudos experimentais, por sua vez, analisam transplantes de pequenos volumes de tecido adiposo, ao redor de 1 ml (5, 6, 10, 15, 19), tornando difícil a avaliação quantitativa de sobrevida. Ou ainda, quantificam achados microscópicos de enxertos em cruzes, dando julgamento subjetivo às respostas teciduais (4).

A heterogeneidade de resultados das publicações sobre este tema estimulou o desenvolvimento deste trabalho, para elucidar de forma quantitativa a sobrevida de enxertia do tecido adiposo, com diferentes métodos de colheita e tratamento.


MATERIAL E MÉTODO

Foram operados 25 coelhos, machos, da raça Nova Zelândia Branca, com 6 meses de idade e peso médio de 4,6 kg.

O tecido adiposo foi colhido do tecido celular subcutâneo das regiões escapulares, no dorso do coelho. Por randomização, um dos lados serviu para liposucção e o outro para dissecção.

O estudo compreendeu 5 modalidades de enxertia do tecido adiposo autólogo. Nas duas primeiras, o tecido foi obtido por sucção, sendo que a cânula de lipoaspiração com orifício de borda romba deu origem ao tecido da modalidade A (aspirado). A modalidade C (corte) foi obtida por cânula de bordas cortantes.

Nas três outras modalidades o tecido adiposo foi colhido por dissecção a céu aberto, com bisturi frio.

Em ambas as formas de sucção, as cânulas apresentavam diâmetro inteiro de 5 mm, bem como a agulha usada para injeção do transplante. A sucção foi produzida por motor de um cavalo de força. O tecido adiposo, extraído pela cânula, ficava coletado em seringa plástica e desta era, a seguir, injetado para a região receptora sem qualquer tipo de manipulação ou tratamento.

O tecido adiposo colhido por dissecção foi fragmentado com tesoura em espécimes de aproximadamente 4 mm. O tecido fragmentado serviu para as modalidades dissecado (D), tratado (T) e lavado (L). O tratado (T) recebeu esta definição por serem adicionados 2 ml de meio de cultura de células 199 com sais de Earle. O lavado (L) foi submetido à lavagem com Ringer-Lactato corrente em peneira.

As áreas receptoras dos enxertos foram as faces convexas das orelhas dos coelhos. Foram injetados 5 ml de tecido adiposo a cada uma das 5 modalidades. O tecido adiposo foi injetado, produzindo um cilindro ao longo do percurso da agulha. A pressão digital para injeção não oferecia qualquer resistência. Não se empregaram antibióticos.

Foram sacrificados 9 coelhos no 7º dia, 8 no 180º dia e outros 8 coelhos no 360º dia.

Os 5 cilindros de tecido foram colhidos das orelhas de todos os animais. Cada cilindro recebeu secções transversais, com distância constante de 1 centímetro (Fig. 1). As peças foram fixadas em formal tamponado 10%, ph 7.4, incluídas em parafina e coradas por hematoxilina-eosina.


Fig. 1 - Esquema de cilindro com secções transversais a cada centímetro para histoplastia.



Índice Morfométrico de Adipócitos, Estroma, Regiões Císticas e Inflamação

O tecido adiposo de 4 animais foi avaliado em todos os cortes microscópicos e em cada período de observação. Quantificou-se o teor de adipócitos, estroma, regiões císticas e inflamação.

Estes índices foram obtidos através do sistema de contagem de pontos, com ocular reticulada, em aumento de 100 vezes. O número médio de pontos contados por cilindro foi de 3503. Cada cilindro teve a soma absoluta dos seus pontos transformada em porcentagem de adipócitos, estroma, regiões císticas e inflamação, aos 7, 180 e 360 dias.

Quatro espécimes de tecido adiposo enxertado, obtidos do dorso de diferentes animais, foram processados em cortes histológicos e submetidos à contagem de pontos com ocular reticulada, para se obter os índices de adipócitos e estroma do tecido original.

Cálculo do Volume de Tecido Adiposo Enxertado Sobrevivente aos 7, 180 e 360 Dias

Todas as áreas de secção dos enxertos, nos diferentes níveis, foram quantificadas em área total em todos os animais dos 3 períodos de observação, com o auxílio de software analisador de imagem JAVA/Jandel Video Systems Inc. Este conjunto integrou computador a monitor de imagens e microscópio óptico, em aumento de 25 vezes. Foram computadas 776 áreas de secção transversa.

O volume final de cada cilindro foi calculado segundo a fórmula:

Integral: V=d.Σ(ai).k; onde:


v - volume (mm3); D - distâncias entre as secções (mm); e (ai) - somatória das áreas (mm2); k -constante para o índice de retração dos tecidos.

Determinação da Constante da Retração dos Tecidos (k)

Dezesseis espécimes de orelhas de coelhos tiveram a superfície da secção transversa avaliada a fresco. A superfície de secção foi carimbada em papel de filtro, demarcando-a. Esta superfície a fresco foi mensurada no analisador de imagens.

A somatória das áreas a fresco dividida pela somatória destas superfícies processadas em lâminas de miocroscopia óptica determinou o índice de retração destes tecidos.

Cálculo do Volume Percentual de Adipócitos Sobreviventes aos 360 Dias

O cálculo final da sobrevida exclusiva de adipócitos seguiu a fórmula:




Os dados referentes ao volume de tecido sobrevivente e os teores de adipócitos, estroma, regiões císticas e inflamação, obtidos no reticulado, foram submetidos a avaliação estatística pelo teste de Friedman, onde p< O,l.


RESULTADOS

As orelhas de todos os coelhos desenvolveram evidente hiperemia e edema, iniciados ao redor do 3º dia que evoluiu espontaneamente na 2ª semana, sem qualquer infecção.

A observação clínica revelou nítida diminuição irregular de volume em todos os coelhos nas 5 modalidades de estudo, aos 180 e 360 dias (Fig. 2).


Fig. 2 - Nota-se significativa sobrevida de volume de tecido transplantado do cilindro corte (C), aos 360 dias.



O tecido adiposo foi de fácil identificação macroscópica nas secções transversas dos cilindros, por diferencial de cor e presença de tênue tecido cicatricial circunscrevendo a área.


MICROSCOPIA

Análise Descritiva

O tecido adiposo transplantado apresentou grande diversidade de comportamento, não só entre os animais e modalidades, como no mesmo cilindro.

7ºDia

A análise microscópica descritiva não permitiu diferenciação entre as 5 modalidades de estudo de enxertia do tecido adiposo, exceção feita quanto à inflamação mais evidente nas modalidades obtidas por sucção. A avaliação microscópica no 7º dia mostrou formação de tecido conjuntivo cicatricial circundando o enxerto.

Nesse período, o processo inflamatório retratado por um exacerbado infiltrado linfo-plasmocitário, ocorreu da periferia para o centro. O enxerto revelou nítido halo basofílico entremeando os adipócitos, correspondendo a um acúmulo de células inflamatórias (Figs. 3 e 4).


Fig. 3a - Tecido adiposo dissecado aos 7 dias. Destacam-se adipócitos rotos, separados por traves irregulares de células inflamatórias, mais evidentes à periferia do tecido transplantado (HE 25x).


Fig. 3b - Tecido adiposo dissecado aos 7 dias. Detalhe da fotografia anterior onde se observam alguns adipócitos rotos parcialmente preenchidos por células inflamatórias, ao lado de outros circundados por macrófagos (HE 160x).


Fig. 4 - Fotomicrografia do enxerto obtido por sucção com cânula de borda com corte. Observa-se, aos 7 dias, lise de adipócitos e formação de cistos de vários tamanhos (HE 25x).



O centro da área transplantada exibiu grande quantidade de adipócitos com arquitetura celular aparentemente preservada, sem sinais de penetração inflamatória ou vascular.

180ºDia

Nas 5 modalidades o tecido adiposo enxertado foi de fácil identificação por ter tênue tecido conjuntivo organizado na sua periferia. Houve grande quantidade de células adiposas com membranas íntegras e persistência marcante de células da inflamação. Estas foram representadas por macrófagos e células gigantes, portadores de grandes vacúolos lipídicos.

Estroma reparacional esteve presente em praticamente todos os cortes, por vezes interceptando grupamentos de células inflamatórias e cistos lipídicos. O tecido conjuntivo fibroso reparacional foi mais freqüente na região central do tecido transplantado. Nesta fase, nas 5 modalidades, áreas de calcificação foram visualizadas em poucos cortes (Fig. 5).


Fig. 5a - Fotomicrografia do tecido adiposo tratado, aos 180 dias. O enxerto é circundado por trabécula de tecido conjuntivo fibroso com alguns septos penetrando-o. Processo inflamatório reparacional ao centro (HE 2Sx).


Fig. 5b - Maior aumento do campo anterior. Célula gigante com citoplasma vacuolizado (HE 400x).


360º DIA

Na maior parte dos cortes encontrou-se tecido enxertado, com predomínio de adipócitos, cuja arquitetura celular manteve-se preservada.

As células da inflamação, principalmente macrófagos e células gigantes, o estroma central organizado e os cistos descritos aos 180 dias, aqui estavam presentes de maneira atenuada (Fig. 6, 7).


Fig. 6a - Tecido adiposo lavado, aos 360 dias. Fotomicrografia. Enxerto de tecido adiposo circundando por delicada faixa de tecido conjuntivo fibroso. (HE 25x).


Fig. 6b - Cistos de grande tamanho entremeados por tecido reparacional e células fagocitárias (HE 1OOx).


Fig. 7 - Corte histopatológico de tecido adiposo aspirado, aos 360 dias, mostrando grande cisto com restos celulares no seu interior. Tecido adiposo quase completamente substituído por tecido conjuntivo fibroso e células fagocitárias. Pequena área de adipócitos entremeando delicados septos conjuntivos (HE 25x).



Índice Morfométrico de Adipócitos, Estroma, Regiões Císticas e Inflamação.

Observou-se, nas 3 fases de avaliação, diversidade de comportamento entre as 5 modalidades de enxerto do tecido adiposo.

7º Dia (Tabela I)

O percentual de adipócitos, em D, T e L, foi próximo de 40%. O aspirado teve 23,3% de adipócitos e o corte 32,2%. As regiões císticas estiveram presentes nas 5 modalidades em índice semelhante (de 30,7% a 36,7%). A inflamação foi mais intensa no aspirado (31,7%) e corte (25,5%). As modalidades D, T e L, tiveram índices de inflamação ao redor de 17,5%.


Tabela I - Percentuais médios de adipocitos, estroma, regiões císticas (R.C) e inflamação aos 7 dias, obtidos no reticulado, nas 5 modalidades.



180º Dia (Tabela II)

O teor de adipócitos oscilou de 43,7 a 67,6% entre as modalidades, sendo que o menor valor foi obtido no corte e o maior, no tratado. Em A e C, as regiões císticas ocuparam índices semelhantes, próximos a 18%. A inflamação foi mais exuberante no aspirado (13, 1 %) e corte (10, 8%). Os teores da inflamação de T e D foram 2,1 % e 3, 7%.


Tabela II - Percentuais médios de adipócitos, estroma, regiões císticas (R.C) e inflamação aos 180 dias, obtidos no reticulado, nas 5 modalidades.



360º Dia (Tabela III)

Nas 5 modalidades, a contagem de adipócitos no reticulado variou de 66,7% a 83,8%, valores considerados estatisticamente semelhantes.

O lavado apresentou a menor contagem de adipócitos, alta porcentagem de estroma (26,0%) e, ainda, a maior porcentagem em regiões císticas (6,2%), com diferença estatisticamente significativa em relação às demais modalidades de estudo.

O dissecado teve 0,1 % de regiões císticas, o menor teor aos 360 dias. Teores também baixos foram registrados no aspirado (1,9%), no corte (1,5%) e no tratado (1,1%).

Um baixo teor de inflamação foi notado em todas as modalidades aos 360 dias. O aspirado apresentou o maior índice de inflamação (1,8%), ficando as demais modalidades ao redor de 1 % (Tabela III).

A morfometria do tecido adiposo não enxertado revelou o teor médio de adipócitos de 83,0% e o de estroma de 17,0%.

A constante de retração dos tecidos (K) de orelhas desde sua colheita a fresco até o processamento em cortes histopatológicos foi de 2,29.


Tabela III - Percentuais médios de adipócitos, estroma, regiões císticas (R.C) e inflamação aos 180 dias, obtidos no reticulado, nas 5 modalidades.



Volume de Tecido Adiposo Remanescente (Tabela IV)

7º Dia - As médias percentuais de volume foram estatisticamente semelhantes entre as modalidades.

180º Dia - Aspirado e lavado mostraram os menores níveis de sobrevivência (23,3 e 22,4%). Corte e dissecado foram os níveis mais preservados, com volumes semelhantes, respectivamente, de 65,1% e 63,8%. Tratado teve 34,5% de sobrevida.

360º Dia - Aspirado e lavado mostraram as mais baixas sobrevivências (16,3% e 20,4%). O maior volume médio remanescentede tecido adiposo enxertado foi o do dissecado, com 45,4%.


Tabela IV - Média percentual de volume remanescente de tecido transplantado aos 7, 180 e 360 dias.



Volume Percentual de Adipócitos Remanescentes (Tabela V)

O cálculo do volume percentual médio de adipócitos remanescentes mostrou que, em C e D, o volume de adipócitos detectado aos 7 dias continuava presente aos 180 e 360 dias.

As modalidades A, T e L apresentaram significativa redução de volume de adipócitos entre 7 e 360 dias.

O maior volume remanescente de adipócitos, aos 360 dias, foi o dissecado (45,2%), seguido pelo corte (34,6%), tratado (27,0%) e lavado. A menor sobrevivência de adipócitos foi no aspirado, com 13,9%.


Tabela V - Volume porcentual médio de adipócitos sobreviventes das 5 modalidades, aos 7, 180 e 360 dias.



DISCUSSÃO

O transplante de tecido adiposo carece de estudos experimentais e de mudanças na sua metodologia de obtenção e tratamento. O seu atual descrédito provavelmente já não será revertido por observações clínicas.

A falta de artigos na literatura que analisassem o transplante livre de tecido adiposo autólogo, sob o prisma da quantificação dos componentes tissulares da sua sobrevida, estimulou a presente pesquisa.

A variação de resultados histopatológicos encontrados entre os cortes de um mesmo cilindro, na presente pesquisa, mostrou o quanto biópsias isoladas podem ser falhas. Esta variação foi ainda intensa dentro de um mesmo corte histopatológico. Este fato motivou a metodologia do presente trabalho a empregar avaliação quantitativa por contagem de pontos.

Os achados histopatológicos incluíram a degeração de adipócitos, formação de cistos e vacúolos, tênue desenvolvimento de tecido conjuntivo capsular e infiltração inflamatória. Estes ítens são concordes com os autores que estudaram o comportamento biológico dos transplantes de tecido adiposo(10, 13, 14, 16, 17 e 18).

A observação microscópica, aos 180 e 360 dias, detonou que a substituição de adipócitos do transplante por tecido inflamatório-reparacional ocorreu no centro do cilindro, como descrito por GURNEY(lO) e ROSSAITI(l9).

A evolução do tecido adiposo aspirado mostra que esta modalidade manteve os mais altos níveis de inflamação aos 180 e 360 dias, respectivamente, de 13,1 e 1,8%. O volume global remanescente do tecido adiposo aspirado foi o mais baixo, 16,3%, aos 360 dias.

Estes valores retratam o trauma que a lipoaspiração causa sobre o tecido quando da sucção com cânula de borda romba.

O tratado apresentou índices semelhantes aos do (D) no retículo, na contagem de adipócitos, estroma e inflamação, aos 7 dias.

No entanto, o volume final do tecido remanescente da modalidade tratado foi de 31,4%, significativamente inferior aos 45, 4% do (D).

A tentativa de melhorar a sobrevida de adipócitos, através da adição de meio de cultura, redundou em prejuízo do transplante, provavelmente por dificultar a adesão do mesmo aos tecidos receptores.

O volume líquido de adipócitos nas modalidades corte e (D) foi mantido constante nas 3 fases de obsevação. Este achado sugere que a lesão de adipócitos deve ter ocorrido predominantemente na colheita ou nos primeiros dias de transplantação.

O mesmo não ocorreu nas modalidades aspirado, tratado e lavado. No aspirado, aos 7 dias o volume líquido de adipócitos foi de 20,4%, sendo reduzido para 13,9% aos 360 dias. No tratado a queda foi de 40,1% aos 7 dias para 27% aos 360 dias. No lavado, a redução foi de 38,6% para 16,4%.

A acentuada queda de adipócitos no lavado faz supor que o ato de lavar com Ringer-lactato não só não promoveu eficiente remoção de lipídio extracelular, pois não diminuiu a inflamação em relação ao (D) e tratado, como também deve ter propiciado elevado índice de pequenas rupturas nas membranas dos adipócitos. Esta suspeita é fortalecida por ser o lavado a modalidade que mais formou regiões císticas aos 360 dias.

Estes resultados se contrapõem aos autores que insistem no valor de lavagens exaustivas do tecido adiposo(2,3,8,9,11,12) e à sugestão da American Society of Plastic and Reconstructive Surgery(1) que recomendou lavagem com solução de Ringer.

O alto índice de adipócitos no reticulado nas 5 modalidades aos 360 dias, variando de 66,7% a 83,8%, dá indícios de que o transplante, nesta fase, apresentou bom nível de estabilidade, principalmente se comparado aos 83% de adipócitos encontrados no tecido adiposo não transplantado. Dá para supor que as áreas ocupadas por inflamação e regiões císticas deverão evoluir por substituição de tecido conjuntivo fibroso, à semelhança do estroma (17%) do tecido original.

Quanto ao tecido transplantado, pode-se deduzir sua viabilidade ao longo da experimentação pelo tipo de resposta tecidual do hospedeiro, mesmo que a microscopia óptica não possa de forma direta afirmar a integridade do adipócito. Aos 7 dias, o tecido lesado suscita acentuada inflamação. Em períodos longos de observação (180 e 360 dias), o adipócito lesado já foi substituído por tecido conjuntivo. Nessas fases, os escassos restos celulares foram fagocitados, facilitando a dedução de que os adipócitos remanescentes devem ser viáveis.

Na modalidade corte, a coerência dos baixos teores de inflamação e estroma e o alto teor de adipócitos do reticulado, aos 360 dias, somada à manutenção do volume líquido de adipócitos dos 7 aos 360 dias, faz deduzir que a lesão de adipócitos ocorreu predominantemente no momento do trauma da colheita.

Entretanto a modalidade (D), que teve o menor trauma possível na colheita, apresentou uma sobrevida de apenas 45%. Como no momento de sua fragmentação, o tecido adiposo foi imerso em solução dita "fisiológica", esta solução torna-se suspeita.

A solução salina recebeu a designação de fisiológica por ser isotônica à hemácia. Tendo sido criada originalmente para fins de infusão endovenosa. Não necessariamente essa isotonicidade se aplica ao adipócito.

Fica a dúvida "o que seria uma solução fisiológica para o adipócito?"

É bem sabido que em laboratórios, quando se quer lesar células em cultura, faz-se adição de água destilada, promovendo a sua rápida entrada na célula por diferença de pressão osmótica e a imediata ruptura da membrana celular.

A atuação saneadora das células inflamatórias produz a liberação de radicais livres, a partir das membranas celulares lesadas. A presença de processo inflamatório, a nível de paniculite, produz absorção de tecido adiposo local, independente de ser ou não tecido transplantado.

A associação destes fatos faz supor que o transplante de tecido adiposo possa ser menos absorvido se for promovida a neutralização dos radicais livres.

A presente pesquisa deixa mais esta dúvida a ser esclarecida no futuro.


CONCLUSÕES

A presente pesquisa de 5 diferentes modalidades de transplante livre de tecido adiposo autólogo, em coelhos, pode concluir :

1. O tecido aspirado por cânula de orifício com borda romba suscitou o maior teor de inflamação e evoluiu com a menor sobrevida.

2. O tecido obtido por aspiração, com cânula de orifício com corte, resultou na segunda maior sobrevida com diferença importante do aspirado.

3. A adição de meio de cultura 199 com sais de Earle ao tecido colhido por dissecção a bisturi-tratado não beneficiou a sobrevida de adipócitos.

4. O ato de lavar o tecido dissecado com Ringer-Lactato, produziu lesão de adipócitos, elevada formação de cistos e baixa sobrevida do transplante adiposo lavado.

5. O tecido dissecado, colhido por bisturi e mergulhado em solução salina fisiológica resultou na maior sobrevida entre as modalidades de estudo.


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I - Prof. Adjunto da Disciplina de Cirurgia Plástica da Escola Paulista de Medicina. Livre docente pela Disciplina de Cirurgia Plástica e Queimaduras da Faculdade de Medicina da USP
II - Pós-graduada em Clínica Cirúrgica pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
III - Professor Adjunto e Chefe do Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental da Faculdade de Medicina da USP
IV - "Research Fellow" em Cirurgia Plástica, Medical College of Wisconsin, EUA.
IV - Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Plástica e Queimaduras da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Endereço para Correspondência:
Américo Marques
Av. República do Líbano, 894
São Paulo - SP 04502-001

Trabalho desenvolvido na Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da EPM e Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental da Faculdade de Medicina da USP.

 

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