ISSN Online: 2177-1235 | ISSN Print: 1983-5175
Influência de um protocolo de criopreservação no rendimento in vitro de células-tronco derivadas do tecido adiposo
Effect of a cryopreservation protocol on the in vitro yield of adipose-derived stem cells
Original Article -
Year2012 -
Volume27 -
Issue
3
Fernanda Ginani1; Diego Moura Soaresa1; Carlos Augusto Galvão Barboza2
RESUMO
INTRODUÇÃO: O tecido adiposo obtido por lipoaspiração pode ser uma fonte acessível de células-tronco, para posterior aplicação clínica na regeneração tecidual. O processo de criopreservação mantém essas células vivas por longos períodos, sem prejuízo a suas funções. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de um protocolo de criopreservação na proliferação das células-tronco derivadas do tecido adiposo.
MÉTODO: Fragmentos de tecido adiposo de camundongos foram submetidos a digestão enzimática e as células foram cultivadas em meio α-MEM (do inglês Minimum Essential Medium), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), e mantidas a 37ºC em 5% de dióxido de carbono. No primeiro subcultivo, uma alíquota de 1x106 células foi criopreservada em SFB com 10% de dimetilsulfóxido por 30 dias, e outro grupo permaneceu em cultura. No terceiro subcultivo, as células dos dois grupos (não-criopreservadas e criopreservadas) foram plaqueadas e a viabilidade celular e as curvas de crescimento foram estabelecidas a partir de contagem em hemocitômetro e pelo ensaio de MTT, nos intervalos de 24 horas, 48 horas e 72 horas. A avaliação da morfologia nuclear foi realizada pela marcação por DAPI. Os dados foram analisados estatisticamente, com nível de significância de 5%.
RESULTADOS: Observou-se padrão de crescimento celular ascendente em ambos os grupos, sem diferença significante ao longo do experimento (P > 0,05). Não houve alteração considerável da viabilidade celular e danos nucleares também não foram observados nos grupos estudados.
CONCLUSÕES: O protocolo de criopreservação avaliado mostrou-se eficaz para manter a integridade das células-tronco de tecido adiposo, permitindo seu armazenamento para uso posterior.
Palavras-chave:
Tecido adiposo. Células-tronco. Criopreservação. Proliferação de células.
ABSTRACT
BACKGROUND: Adipose tissue obtained by liposuction may be an accessible source of stem cells for future clinical application in tissue regeneration. Cryopreservation maintains stem cells in a live state for long periods of time, without impairing their function. The aim of this study was to assess the effect of a cryopreservation protocol on the proliferation of adipose-derived stem cells.
METHODS: Fragments of mouse adipose tissue were subjected to enzymatic digestion in order to isolate cells that were then cultured in minimum essential medium (α-MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Cells were maintained at 37ºC in 5% carbon dioxide (CO2). At the first passage, an aliquot of 1 × 106 cells was cryopreserved in FBS with 10% dimethylsulfoxide (DMSO) for 30 days, whereas the remaining cells were seeded and maintained in culture. When these cells reached the third passage, the 2 groups of cells (cryopreserved and non-cryopreserved) were seeded for experiments. Cell viability and proliferation curves were established at intervals of 24, 48, and 72 hours by counting cells with a hemocytometer and MTT assay. Nuclear morphology was assessed by DAPI staining. The data were statistically analyzed, with a significance level of 5%.
RESULTS: Increasing cellular proliferation was observed in both groups, with no significant difference throughout the experiment (P > 0.05). There was no significant change in cell viability and signs of nuclear damage were not detected in both the groups studied.
CONCLUSIONS: The cryopreservation protocol analyzed was effective for maintaining the integrity of adipose-derived stem cells, allowing their storage for later use.
Keywords:
Adipose tissue. Stem cells. Cryopreservation. Cell proliferation.
INTRODUÇÃO
As células-tronco adultas são responsáveis pela reposição das células dos tecidos onde se encontram ao longo de toda a vida, tendo sido isoladas de vários órgãos, incluindo o tecido adiposo1,2. Esse tecido altamente complexo consiste de adipócitos maduros, pré-adipócitos, fibroblastos, células endoteliais, monócitos/macrófagos residentes e linfócitos3. Esse tecido tem sido foco de pesquisas com células-tronco, uma vez que fornece rica fonte de células pluripotentes4,5.
As células-tronco derivadas do tecido adiposo (adipose tissue-derived stem cells - ADSCs) apresentam um potencial de diferenciação semelhante ao das células-tronco derivadas da medula óssea, podendo originar células e tecidos de origem mesodérmica, como adipócitos, cartilagem, osso e músculo esquelético6. No entanto, o principal benefício das ADSCs é que elas podem ser facilmente obtidas dos pacientes através de um método simples e minimamente invasivo, além de serem facilmente cultivadas7.
A necessidade de manter as células vivas por um longo período sem a perda de suas funções levou ao desenvolvimento de técnicas de criopreservação, que têm como objetivo cessar reversivelmente, de forma controlada, todas as funções biológicas dos tecidos vivos em uma temperatura ultrabaixa, geralmente por volta de -196ºC8. Outra possibilidade é realizar a criopreservação celular na temperatura de -80ºC, o que garante resultados semelhantes quando se usa o nitrogênio líquido, conforme citam Woods et al.9, que criopreservaram células mesenquimais indiferenciadas da polpa dentária por 6 meses nas duas temperaturas supracitadas e observaram capacidade de diferenciação celular idêntica nos dois grupos.
Entretanto, é extremamente necessário determinar se o processo de criopreservação afeta tanto a capacidade proliferativa das células criopreservadas como seu potencial de diferenciação, tendo em vista que uma dificuldade da criopreservação é o restabelecimento das propriedades biológicas das células após o descongelamento. Face ao exposto, o presente estudo tem como objetivo avaliar, por meio de experimentos in vitro, a influência de um protocolo mais simples de criopreservação na capacidade proliferativa das ADSCs.
MÉTODO
Obtenção e Cultivo Celular
O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, com o Parecer nº 036/2012. Dois camundongos albinos Swiss machos, com 3 meses de idade, pesando em média 30 g, foram submetidos a eutanásia com dose letal de pentobarbital sódico (150 mg/kg, intraperitoneal), e fragmentos de tecido adiposo foram extraídos da região inguinal. Em câmara de fluxo laminar, os espécimes foram submetidos a três lavagens de 10 minutos cada, com meio α-MEM (Minimum Essential Medium - Cultilab, Brasil) enriquecido com antibiótico e antifúngico (Gibco, Estados Unidos), objetivando eliminar possível contaminação.
Posteriormente, o tecido adiposo foi submetido a digestão enzimática com solução contendo 3 mg/ml de colagenase I (Gibco, Estados Unidos) e 1 ml de tripsina/EDTA (Cultilab, Brasil) por uma hora a 37ºC. As células foram cultivadas em meio α-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e mantidas a 37ºC em 5% de dióxido de carbono (CO2) até atingirem entre 70% e 90% de confluência, com troca de meio a cada três dias.
Uma alíquota das células foi cultivada em meios de diferenciação osteogênico e adipogênico (StemPro® Differentiation Kits, Invitrogen Corp., Estados Unidos) por até 21 dias. Após esse período, as células exibiram, à microscopia de luz, morfologia característica de células osteoblásticas e adiposas, comprovando a natureza multipotencial dessas células.
Criopreservação
No primeiro subcultivo (P1), uma alíquota de 1x106 células foi submetida a criopreservação em SFB com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), de acordo com o seguinte protocolo: 2 horas a 4ºC, 18 horas a -20ºC e, então, mantidas a -80ºC por um período de 30 dias. Após esse tempo, as células foram descongeladas e seguiu-se com o cultivo celular semelhante ao de células que não foram criopreservadas (P2).
Avaliação da Proliferação e da Viabilidade Celulares
No terceiro subcultivo (P3), células de cada grupo (não-criopreservadas e criopreservadas) foram cultivadas em quadruplicata (n = 4), na densidade de 3x104 células/poço, a fim de se obter o rendimento e a curva de crescimento nos diferentes grupos, durante os intervalos de 24 horas, 48 horas e 72 horas após o plaqueamento. A proliferação e a viabilidade celulares foram avaliadas por meio de contagem utilizando o método de exclusão pelo azul de tripan. Outro método de estudo da proliferação celular utilizado foi o ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio], em que as células foram cultivadas em placas de 96 poços, na densidade de 5x103 células/poço, durante os mesmos intervalos. A densidade óptica foi obtida pela leitura das placas em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 570 nm.
Avaliação de Danos Morfológicos Nucleares
A marcação dos núcleos celulares foi realizada nos dois grupos estudados por meio do corante DAPI (4', 6'-diamino-2-fenilindol), no intervalo de 72 horas, com a finalidade de identificar possíveis alterações na morfologia do núcleo indicativas de apoptose, tais como condensação de cromatina e fragmentação nuclear.
Análise Estatística
Os dados foram submetidos a análise não-paramétrica. A diferença entre os grupos para cada um dos intervalos estudados (24 horas, 48 horas e 72 horas) foi analisada pelo teste estatístico de Mann-Whitney, considerando-se um nível de significância de 5% (P < 0,05).
RESULTADOS
Curvas de crescimento ascendentes foram observadas tanto nas células não-criopreservadas como nas criopreservadas, com maior tendência à proliferação no grupo de células criopreservadas (Figura 1).
Figura 1 - Curva de crescimento das células não-criopreservadas e criopreservadas, nos intervalos estudados. Crio = criopreservadas; Não-Crio = não-criopreservadas; T24 = 24 horas; T48 = 48 horas; T72 = 72 horas.
Comparando-se as médias das contagens celulares obtidas no grupo de células não-criopreservadas e criopreservadas, a partir do método de exclusão por azul de tripan, verificou-se que não houve diferença estatisticamente significante. Esse método também permitiu a avaliação da viabilidade celular, demonstrando que não houve alteração considerável (Tabela 1). Do mesmo modo, o método de ensaio de MTT também não apresentou diferença estatística significante (P > 0,05) em relação à proliferação celular observada nos dois grupos, nos intervalos estudados (Figura 2).
Figura 2 - Atividade mitocondrial das células-tronco derivadas do tecido adiposo nos grupos estudados. Crio = criopreservadas; Não-Crio = não-criopreservadas; T24 = 24 horas; T48 = 48 horas; T72 = 72 horas.
Não foi observada alteração morfológica no núcleo (como fragmentação nuclear ou núcleos picnóticos) nas ADSCs em nenhum dos grupos (Figura 3).
Figura 3 - Em A, fotomicrografia das células não-criopreservadas, no intervalo de 72 horas. Em B, fotomicrografia das células criopreservadas, no intervalo de 72 horas (DAPI, 40x).
DISCUSSÃO
Atualmente, a lipoaspiração vem sendo um procedimento bastante comum nas clínicas de estética. Ao término desse tipo de cirurgia, grande quantidade de tecido adiposo é prontamente obtida. Além de ser utilizado para preenchimentos, a fim de proporcionar aumento de tecido mole, o tecido adiposo também pode ser bastante útil como fonte de células-tronco para a regeneração tecidual10. Assim, a criopreservação tem sido investigada com o intuito de armazenar o tecido adiposo (ou células específicas) para utilização posterior.
Diversos estudos na literatura relatam tempos distintos de criopreservação, que variam de um dia a intervalos maiores11,12. O tempo de avaliação utilizado neste artigo também está respaldado na literatura, em diversos autores que avaliaram o processo de criopreservação por 30 dias9,13,14, sem diferenças significativas na proliferação e na capacidade de diferenciação celular das células criopreservadas quando comparadas às não-criopreservadas.
Com o objetivo de avaliar as capacidades multipotencial e proliferativa das ADSCs humanas criopreservadas, Gonda et al.12 mantiveram essas células em baixas temperaturas por 6 meses. Após esse período, observaram que o grupo de células criopreservadas demonstrou potencial de proliferação e de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica semelhante ao do grupo de células não-criopreservadas. Uma diferença destacada pelos autores foi a maior variabilidade no potencial de diferenciação condrogênica para as células criopreservadas. No que se refere à proliferação, esses resultados corroboram os encontrados em nosso estudo, em que ambos os grupos (células não-criopreservadas e criopreservadas) tiveram curva de proliferação celular ascendente.
Thirumala et al.15,16, estudando a criopreservação de células estaminais de tecido adiposo, comentam principalmente o efeito físico que os processos de congelamento e descongelamento podem causar na integridade dessas células. A partir da marcação pelo DAPI, podemos afirmar que o protocolo de criopreservação utilizado no presente estudo manteve íntegras as membranas nucleares, bem como a morfologia do núcleo.
Os protocolos de criopreservação para as células-tronco de tecido adiposo apresentados na literatura mantêm esse tipo celular em uma temperatura de -196ºC (nitrogênio líquido)12,17,18, o que gera alto custo de manutenção e não está acessível a todos os laboratórios de pesquisa. Neste estudo, utilizou-se um protocolo mais simples, mais acessível e de baixo custo, mantendo as células a uma temperatura de -80ºC e ainda assim preservando sua viabilidade.
Liu et al.19 observaram resultados semelhantes aos deste estudo, quando criopreservaram células-tronco de tecido adiposo humano por duas semanas. Em outro estudo, células-tronco de tecido adiposo de cães foram criopreservadas durante 12 meses e depois de descongeladas apresentaram taxa proliferativa semelhante à do grupo de células não-criopreservadas17. É possível que o tempo em que as células permanecem criopreservadas possa afetar sua viabilidade, porém períodos mais curtos, como o utilizado neste estudo (30 dias), ou mais longos (12 meses), como o estudado por Martinello et al.17, não são capazes de alterar a proliferação celular. Com base nesses achados da literatura, é provável que se possa prolongar o período de criopreservação dessas células. No entanto, devem ser avaliados possíveis danos desses períodos mais longos de criopreservação no tipo celular em questão.
Entre os vários parâmetros relativos à criopreservação de células, os agentes crioprotetores também podem afetar significativamente a taxa de sobrevivência e o potencial de proliferação após o descongelamento. Optamos por utilizar o DMSO, por ser amplamente utilizado para a criopreservação de diversos tipos celulares11,17. Como observado neste trabalho, esse agente forneceu resultados favoráveis em termos de viabilidade celular e capacidade proliferativa após a criopreservação das ADSCs, por um período de 30 dias.
A velocidade de diminuição da temperatura no congelamento pode ser outro fator crucial para a viabilidade celular após a criopreservação, e deve ser determinada para cada célula específica, a fim de evitar a formação de cristais de gelo intracelulares20. Adotamos um protocolo padrão para outros tipos celulares em cultura, como relatado por Vasconcelos et al.14 (2 horas a 4ºC, 18 horas a -20ºC, e, em seguida, armazenamento a -80ºC durante 30 dias), protocolo este que demonstrou ser bastante efetivo para as ADSCs.
Em geral, os resultados do presente estudo demonstraram que o protocolo de criopreservação utilizado pode ser uma ferramenta adequada para o armazenamento de ADSCs, permitindo seu uso posterior em experimentos in vivo, na busca por futuras aplicações clínicas.
CONCLUSÕES
O protocolo de criopreservação testado mostrou-se eficaz para manter a integridade das ADSCs, conservando sua capacidade proliferativa sem causar danos morfológicos nucleares.
REFERÊNCIAS
1. Levi B, Longaker MT. Concise review: adipose-derived stromal cells for skeletal regenerative medicine. Stem Cells. 2011;29(4):576-82.
2. De Rosa A, De Francesco F, Tirino V, Ferraro GA, Desiderio V, Paino F, et al. A new method for cryopreserving adipose-derived stem cells: an attractive and suitable large-scale and long-term cell banking technology. Tissue Eng Part C Methods. 2009;15(4):659-67.
3. Caspar-Bauguil S, Cousin B, Galinier A, Segafredo C, Nibbelink M, André M, et al. Adipose tissues as an ancestral immune organ: site-specific change in obesity. FEBS Lett. 2005;579(17):3487-92.
4. Prunet-Marcassus B, Cousin B, Caton D, André M, Pénicaud L, Casteilla L. From heterogeneity to plasticity in adipose tissues: site-specific differences. Exp Cell Res. 2006;312(6):727-36.
5. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12):4279-95.
6. Nakagami H, Morishita R, Maeda K, Kikuchi Y, Ogihara T, Kaneda Y. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. J Atheroscler Thromb. 2006;13(2):77-81.
7. Sterodimas A, de Faria J, Nicaretta B, Pitanguy I. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applications. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010;63(11):1886-92.
8. De Santis GC, Prata KL. Criopreservação de células-progenitoras hematopoéticas. Medicina. 2009;42(1):36-47.
9. Woods EJ, Perry BC, Hockema JJ, Larson L, Zhou D, Goebel WS. Optimized cryopreservation method for human dental pulp-derived stem cells and their tissues of origin for banking and clinical use. Cryobiology. 2009;59(2):150-7.
10. Moseley TA, Zhu M, Hedrick MH. Adipose-derived stem and progenitor cells as fillers in plastic and reconstructive surgery. Plast Reconstr Surg. 2006;118(3 Suppl):121S-8.
11. Papaccio G, Graziano A, d'Aquino R, Graziano MF, Pirozzi G, Menditti D, et al. Long-term cryopreservation of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source for tissue repair. J Cell Physiol. 2006;208(2):319-25.
12. Gonda K, Shigeura T, Sato T, Matsumoto D, Suga H, Inoue K, et al. Preserved proliferative capacity and multipotency of human adiposederived stem cells after long-term cryopreservation. Plast Reconstr Surg. 2008;121(2):401-10.
13. Temmerman L, Beele H, Dermaut LR, Van Maele G, De Pauw GA. Influence of cryopreservation on the pulpal tissue of immature third molars in vitro. Cell Tissue Bank. 2010;11(3):281-9.
14. Vasconcelos RG, Ribeiro RA, Vasconcelos MG, Lima KC, Barboza CA. In vitro comparative analysis of cryopreservation of undifferentiated mesenchymal cells derived from human periodontal ligament. Cell Tissue Bank. 2011;13(3):461-9.
15. Thirumala S, Gimble JM, Devireddy RV. Transport phenomena during freezing of adipose tissue derived adult stem cells. Biotechnol Bioeng. 2005;92(3):372-83.
16. Thirumala S, Zvonic S, Floyd E, Gimble JM, Devireddy RV. Effect of various freezing parameters on the immediate post-thaw membrane integrity of adipose tissue derived adult stem cells. Biotechnol Prog. 2005;21(5):1511-24.
17. Martinello T, Bronzini I, Maccatrozzo L, Mollo A, Sampaolesi M, Mascarello F, et al. Canine adipose-derived-mesenchymal stem cells do not lose stem features after a long-term cryopreservation. Res Vet Sci. 2011;91(1):18-24.
18. Miyamoto Y, Oishi K, Yukawa H, Noguchi H, Sasaki M, Iwata H, et al.Cryopreservation of human adipose tissue-derived stem/progenitor cells using the silk protein sericin. Cell Transplant. 2012;21(2-3):617-22.
19. Liu G, Zhou H, Li Y, Li G, Cui L, Liu W, et al. Evaluation of the viability and osteogenic differentiation of cryopreserved human adipose-derived stem cells. Cryobiology. 2008;57(1):18-24.
20. Hubel A. Parameters of cell freezing: Implications for the cryopreservation of stem cells. Transfus Med Rev. 1997;11(3):224-33.
1. Especialista em Ciências Morfológicas, mestrando do Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brasil.
2. Doutor em Patologia Bucal, professor associado do Departamento de Morfologia da UFRN, Natal, RN, Brasil.
Correspondência para:
Carlos Augusto Galvão Barboza
Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Av. Salgado Filho, 3.000 - Campus Universitário
Natal, RN, Brasil - CEP 59072-970
E-mail: cbarboza@cb.ufrn.br
Artigo submetido pelo SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da RBCP.
Artigo recebido: 12/6/2012
Artigo aceito: 7/8/2012
Suporte Financeiro: CAPES
Trabalho realizado na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brasil.
All scientific articles published at www.rbcp.org.br are licensed under a Creative Commons license
