ABSTRACT

Background: Fetal calf serum (FCS) is commonly used as supplement in the culture medium for fibroblast cell cultures. This form of supplementation is far from ideal, as samples quality varies from batch to batch and its composition is not completely known. FCS may contain virus and prion contamination and it may also cause immunologic complications to humans. Due to those facts, a worldwide effort is being made to find alternatives to the use of xenobiotic elements in cell cultures. Human serum would be a safer alternative for FCS use, providing maintenance for cell in clinical appliance. Methods: We assayed human serum as a replacement of FCS in human fibroblasts culture. Human serum was obtained from blood of 10 healthy volunteers, submitted to serological evaluation. Fibroblasts were cultivated in multiwell plates containing either Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) plus 10% FCS (D₁₀) or DMEM plus 10% human serum (D₁₀H). After 24 to 264 hours cells were counted and results were expressed in mean ± standard error of the mean to obtain cell proliferation curves. Results: There was no statistical difference between both proliferation groups. Human serum supported growth and proliferation of human fibroblasts, with a potential as substitute for FCS in cell culture. Cell morphology was different in human serum presence appearing to be smaller and rounded as compared to cells kept in D₁₀. Conclusions: These results allow us to infer that human serum can substitute FCS in fibroblasts cell culture, and that fibroblasts cultured in human serum present morphology similar to in vivo fibroblasts.

Keywords: Serum. Cell culture techniques. Cells, cultured. Fibroblasts. Cell proliferation.

RESUMO

Introdução: Soro bovino fetal (SBF) é comumente usado como suplemento no meio de cultura para cultivar fibroblastos. Essa forma de suplementação, porém, não é ideal, pois a qualidade das amostras de SBF é variada e sua composição não é completamente conhecida. Além disso, o SBF pode apresentar contaminação por vírus e príons ou causar complicações imunológicas. Assim, a comunidade científica tem buscado alternativas ao uso de elementos xenobióticos em cultura celular. O soro humano pode ser uma dessas alternativas, principalmente para aplicação clínica. Métodos: Soro humano, obtido de sangue de 10 voluntários saudáveis submetidos a avaliação sorológica prévia, foi testado como substituto do SBF em cultura de fibroblastos humanos. As células foram cultivadas em placas multipoços, contendo Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mais 10% de SBF (D₁₀) ou DMEM mais 10% de soro humano (D₁₀H). Entre 24 e 264 horas de exposição aos meios testados, as células foram contadas e os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média, para obtenção de curvas de proliferação celular. Resultados: Não houve diferença estatística entre os grupos de proliferação. Fibroblastos na presença de soro humano aparentavam ser menores e mais arredondados em comparação àqueles mantidos em D₁₀. Conclusões: Os resultados permitem inferir que o soro humano pode substituir o SBF em cultura de fibroblastos e que fibroblastos cultivados em meio suplementado por soro humano apresentam morfologia mais semelhante àqueles in vivo.

Palavras-chave: Soro. Técnicas de cultura de células. Células cultivadas. Fibroblastos. Proliferação celular.

ABSTRACT

Background: Human skin is a tegument composed by two different layers: a dermis and epidermis. In situations like trauma and burns, partial or complete loss of this tegument may occur. In 1979, Bell et al. have demonstrated that human fibroblast cultivated over a type I mouse collagen lattice could cause contract that lattice. Methods: In this study, we construct an artificial skin equivalent composite using keratinocytes, cultured over a collagen lattice populated by fibroblasts. This cocultured system was investigated for 3 weeks, and saw in the light microscopic level in the days 4, 7, 14 and 21 days. Results: This study showed the stratification and differentiation of the epithelium in contact with the air is much better than without. Maybe, this system can be use like a skin-substitute.

Keywords: Keratinocytes. Fibroblasts. Artificial skin. Collagen

RESUMO

Introdução: Dentre as diversas pesquisas realizadas na área de bioengenharia de tecidos, a criação in vitro de tecidos vivos tornase uma das mais promissoras formas de atuação científica. Neste caminho, cada vez mais têm sido descritos novos substitutos cutâneos para o tratamento de grandes lesões da pele. Bell et al. descreveram um modelo de matriz colágena tipo I contrátil após a adição de fibroblastos. Método: O presente estudo propõe a elaboração in vitro de um equivalente dermo-epidérmico composto por uma "derme" de colágeno povoada por fibroblastos, acompanhado de um epitélio de queratinócitos cultivados em sua superfície anterior no papel de "epiderme". Além disso, estuda as alterações histológicas encontradas nos dias de cultura 4, 7, 14 e 21, avaliando a influência da interface ar-líquido na estratificação do epitélio. Resultados: Os resultados mostraram que houve a criação de um substituto dermo-epidérmico in vitro, com a formação de um epitélio com boa estratificação, sendo que o contato com o ar aumenta esta estratificação.

Palavras-chave: Ceratinócitos. Fibroblastos. Pele artificial.Colágeno

ABSTRACT

Background: The possible participation of keratinocytes in wound remodeling has been widely studied. This study investigated the impact of keratinocytes in wound contraction. Methods: Murine type I collagen gels populated by human fibroblasts and seeded with human keratinocytes on the surface to form a dermo-epidermal equivalent were used as the study group. Collagen gels populated by only fibroblasts were used as the control group. The criteria for the preparation and storage of gels were similar for both groups. Results: An evident and statistically significant increase in gel contraction was observed in samples populated by keratinocytes compared to the control group. Conclusions: These results suggest that keratinocytes not only modulate fibroblast proliferation but also play an active role in wound contraction per se. Further research on the mechanisms involved in the communication pathways between cells and between cells and the matrix shall be assessed from the perspective of keratinocyte participation in wound healing and pathologic scarring.

Keywords: Keratinocytes. Wound healing. Cell culture techniques. Fibroblasts.

RESUMO

Introdução: A eventual participação de queratinócitos na remodelagem da ferida tem sido estudada há muito tempo. Este trabalho investigou o impacto dos queratinócitos na contração da ferida. Métodos: Foi utilizado gel de colágeno tipo I murino povoado por fibroblastos humanos com queratinócitos humanos semeado na superfície (grupo estudo), formando um equivalente dermoepidérmico. Géis de colágeno povoado apenas por fibroblastos foram utilizados como grupo controle. Os critérios de confecção e armazenagem dos géis foram iguais para ambos os grupos. Resultados: Houve aumento evidente e estatisticamente significante na contração de gel das amostras povoadas por queratinócitos, em comparação ao grupo controle. Conclusões: Esses resultados sugerem que os queratinócitos não só podem modular a proliferação de fibroblastos, mas também, por si só, desempenhar papel ativo na contração da ferida. Novas investigações sobre mecanismos envolvidos nas vias de comunicação entre células e entre célula e matriz devem ser avaliadas sob o ponto de vista de participação dos queratinócitos na cicatrização de feridas e formação de cicatrizes patológicas.

Palavras-chave: Queratinócitos. Cicatrização. Técnicas de cultura de células. Fibroblastos.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Chronic ulcers of the lower limbs may have different etiologies, with the most frequent being venous, arterial, traumatic, infectious, and diabetic. The treatment of these wounds is dynamic and depends on the evolution of tissue repair. This treatment includes clinical and surgical methods, and dressings are the most frequently used. Dressings can range from inert covers to vehicles for actuation of active substances in the wound bed. The main indication for these substances is related to the effects of debridement and control of the bacterial population, enabling the preparation of wound beds for surgical or spontaneous resolution. METHODS: This study is an observational, cross-sectional, retrospective study, with random sampling, aimed at assessing the care provided to patients with chronic ulcers of the lower limbs in the Outpatient Clinic for chronic wounds of the Plastic Surgery Division, HCFMUSP, between 2011 and 2013. RESULTS: The clinical charts of 481 patients of both sexes, with a mean age 60 years, were analyzed; all had chronic ulcers in different stages of evolution. Comorbidities, underlying disease, size of the lesion, treatments, and evolution of wounds were evaluated. A predominance of vascular disease (69.2%) was the underlying cause. All patients were initially treated with dressings containing active agents, for preparation of the wound bed. Of these, 84% were referred for surgical management of wounds. There was no spontaneous closure in 1.5% of cases. The remaining patients (14.5%) showed worsening of lesions with topical treatment, and required other forms of preparation of the wound bed. CONCLUSION: Topical agents may be an effective outpatient/home method to prepare the wound bed of chronic ulcers for surgical management.

Keywords: Leg ulcer; Venous ulcers; Diabetic foot; Diabetic ulcers of the foot; Healing; Papain

RESUMO

INTRODUÇÃO: Úlceras crônicas em membros inferiores podem apresentar diferentes etiologias, sendo as mais frequentes: venosa, arterial, traumática, infecciosa e diabética. O tratamento dessas feridas é dinâmico e depende da evolução da reparação tecidual. Esse tratamento inclui métodos clínicos e cirúrgicos, sendo o curativo o método não cirúrgico mais frequentemente utilizado. Curativos podem ser desde de coberturas inertes até veículos para atuação de princípios ativos no leito da ferida. A principal indicação de ativos está relacionada a efeitos de desbridamento e controle da população bacteriana, possibilitando o preparo desses leitos para resolução cirúrgica ou espontânea. MÉTODO: Esse estudo é observacional, longitudinal, retrospectivo, de amostra randomizada no qual pretendemos analisar o atendimento prestado aos portadores de úlceras crônicas em membros inferiores no Ambulatório de Feridas Crônicas da Divisão de Cirurgia Plástica do HCFMUSP entre 2011 e 2013. RESULTADOS: Foram analisados prontuários de indivíduos de ambos os gêneros, idade média 60 anos, portadores de úlceras crônicas em diferentes estágios evolutivos. Foram pesquisadas comorbidades, doença de base, tamanho da lesão, tratamentos utilizados e evolução das feridas. Notouse predomínio das causas vasculares (69,2%) como doenças de base. Todos os pacientes foram primeiramente tratados com curativos contendo princípios ativos, para preparo do leito das feridas. Desses, 84% foram encaminhados para resolução cirúrgica das feridas. Houve fechamento espontâneo em 1,5% dos casos. Os demais pacientes (14,5%) apresentaram piora das lesões com tratamento tópico, necessitando outras formas de preparo desse leito. CONCLUSÃO: Agentes tópicos podem ser uma forma ambulatorial/domiciliar efetiva de preparo do leito de úlceras crônicas para resolução cirúrgica.

Palavras-chave: Úlcera de perna; Úlcera venosa; Pé diabético; Úlcera diabética do pé; Cicatrização; Papaína.

ABSTRACT

Background: The appropriate formation of the granulation tissue depends on the balance between the biosyntheses and the degradation of the extracellular matrix (EM). The excessive synthesis of collagen and the deficient degradation of the EM might cause dermal lesions such as keloids and hypertrophic scars. Methods: In this study we used an experimental model where collagen gels populated by dermal human fibroblast underwent progressive contraction. Fluorescence preparations were studied by confocal microscopy. Collagenase activity (MMP-I) was determined in conditioned medium from fibroblasts using immunoblot. Results: This study showed a greater contraction of the gels populated with control fibroblasts per the time studied in relation to the gels populated with fibroblasts treated with verapamil. Perhaps this higher contracting ability is involved with actin organization and levels of cytosolic calcium. We also observed that verapamil increase the secretion of MMP-I. Conclusion: We conclude that cellular calcium metabolism appears to regulate EM production and contraction and those hypertrophic disorders of wound healing (keloids and hypertrophic scars) may respond to therapy with calcium antagonist drugs (verapamil).

Keywords: Verapamil. Fibroblasts. Collagen. Extracellular matrix.

RESUMO

Introdução: A adequada formação do tecido de granulação depende do equilíbrio entre a biossíntese e a degradação da matriz extracelular (MEC). A síntese excessiva de colágeno e a deficiente remodelação da MEC podem induzir o aparecimento de lesões dérmicas tipo quelóides e cicatrizes hipertróficas. Método: No presente estudo, utilizamos fibroblastos dérmicos humanos povoados em gel de colágeno I, tratados ou não pelo bloqueador de canal de cálcio (verapamil). Uma vez no gel de colágeno, a morfologia tridimensional dos fibroblastos foi analisada por microscopia confocal e em cortes corados por hematoxilina & eosina. A atividade da colagenase (MMP-I) foi determinada por "immunoblot" do meio condicionado. Resultados: Observamos neste estudo maior contração do gel de colágeno povoado por fibroblastos controle, quando comparado ao gel povoado por fibroblastos tratados com verapamil. A maior contração demonstrada pelos fibroblastos controle foi relacionada à reorientação das fibras colágenas, à organização dos filamentos de actina e aos níveis de cálcio citosólico. Observamos, também, que o verapamil aumenta a secreção de colagenase. Conclusão: Concluímos que o verapamil, ao alterar o metabolismo celular do cálcio, exerce influência sobre a contração da MEC e produção de proteases, com consequente efeito sobre o desenvolvimento de afecções cicatriciais, como quelóides e cicatrizes hipertróficas.

Palavras-chave: Verapamil. Fibroblastos. Colágeno. Matriz extracelular.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Autologous skin grafts are used for treatment of burn patients. These grafts can be stored and preserved, as long as the storage process is performed with strict quality control to reduce the risk of infection. METHODS: A retrospective cohort study was conducted in the Burn Unit of the Hospital das Clínicas de São Paulo from February 2015 to July 2016. During this period, a protocol was established to store refrigerated skin, with control of collection, preservation, and packaging, and recording of all processes. To ensure quality, graft biopsies were collected for pre- and post-storage microbiology testing and a cross-sectional study for contamination was performed. RESULTS: Critical deficiencies included inadequate packaging, lack of processing records, lack of biopsies for microbiology testing, and failure to discard specimens. Most of the samples were contaminated before and after storage (84.2%). Only two samples were sterile before storage but became contaminated after storage, with growth of Gram-positive skin bacteria. CONCLUSION: A promising method for the storage of refrigerated skin was established, but requires minor adjustments in quality control.

Keywords: Autologous transplantation; Skin grafting; Tissue preservation; Quality control; Refrigeration.

RESUMO

INTRODUÇÃO: Enxertos de pele autólogos são utilizados em tratamento de pacientes queimados. Esses enxertos podem ser armazenados e preservados, desde que o processo de armazenamento seja realizado com rígido controle de qualidade, para garantir a redução dos riscos de infecção. MÉTODOS: Foi realizado um estudo de coorte retrospectivo na Unidade de Queimados do Hospital das Clínicas de São Paulo no período de fevereiro de 2015 a julho de 2016, em que foi estabelecido um protocolo para armazenamento de pele refrigerada com controle de coleta, preservação, embalagem e registro de todos os processos. Para garantia de qualidade, foram coletadas biópsias dos enxertos para microbiologia pré e pós-armazenamento e realizado um estudo transversal de prevalência de contaminação pré e pós-estocagem. RESULTADOS: Os pontos críticos encontrados foram inadequação de embalagem, ausência de registros de processos, falta de coleta de biópsias para microbiologia e falhas no descarte. A maior parte das amostras estava contaminada tanto pré como pós-estocagem (84,2%). Apenas dois pacientes apresentaram microbiologia estéril no pré e contaminada no pós, porém foram encontrados germes da pele do tipo gram+. CONCLUSÃO: Foi estabelecido um método promissor de armazenamento de pele refrigerada que necessita alguns pequenos ajustes para adequação ao controle de qualidade.

Palavras-chave: Transplante autólogo; Transplante de pele; Preservação de tecido; Controle de qualidade; Refrigeração.

ABSTRACT

Complex wounds are characterized by complete loss of cutaneous cover. The most common plastic surgery technique is the autogenous skin graft; however, the amount of material available from donor areas is often limited. The development of synthetic or biological products as skin substitutes is therefore an area of interest. The present study aimed to classify the different types of skin substitutes available based on three criteria: the skin layer to be replaced, which can be categorized into epidermal (E), dermal (D), and dermal-epidermal composites (C); the durability in the wound bed, which can be temporary (T) or permanent (P); and the origin of the material, subdivided into biological (b), biosynthetic (bs), and synthetic (s).

Keywords: Tissue engineering. Cells, cultured. Skin, artificial.

RESUMO

Feridas complexas podem resultar na perda completa do revestimento cutâneo. A solução consagrada pela cirurgia plástica é a enxertia de pele autógena, porém há casos em que ocorre escassez de área doadora cutânea, um problema ainda não totalmente solucionado. Assim, atualmente há muito interesse por materiais sintéticos ou biológicos que possam ser utilizados como substitutos cutâneos. O objetivo deste estudo foi introduzir uma forma mais didática de agrupar diferentes tipos de substitutos cutâneos. Acreditamos que esses produtos podem ser classificados de forma mais abrangente se forem divididos segundo três critérios: camada substituída da pele, subdivididos em epidérmicos (E), dérmicos (D) e compostos dermoepidérmicos (C); duração no leito da ferida, subdivididos em temporários (T) e permanentes (P); e origem do material constituinte, subdivididos em biológicos (b), biossintéticos (bs) e sintéticos (s).

Palavras-chave: Engenharia tecidual. Células cultivadas. Pele artificial.