Reparação da parede abdominal com membranas acelulares de pericárdio bovino - Parte II - Análises histológicas e morfométricas
Repair of the abdominal wall with acellular bovine pericardial membranes - Part II - Histological and morphometric analyses

INTRODUÇÃO

A reparação de defeitos estruturais com tecidos endógenos, sem dúvida uma habilidade dos cirurgiões plásticos, é limitada em muitas situações e estimulou a produção de biomateriais de suporte, com inúmeros materiais sintéticos desenvolvidos e utilizados em larga escala para aplicações em vários campos da cirurgia reconstrutiva.

Dentro de uma evolução desse processo, desenvolveram-se as próteses biológicas, originadas a partir de tecidos naturais acelularizados¹, fornecendo um suporte tridimensional biodegradável para o crescimento celular do receptor e exigindo uma cinética de degradação sofisticada ao longo do tempo². Representadas basicamente pela membrana extracelular (MEC) resultante do processo de acelularização, essas membranas desenvolvem um papel biológico ativo no local de implantação, em tese favorecendo a remodelação tecidual ao invés da formação de fibrose cicatricial ou inflamação crônica³, conceitos perseguidos no campo da medicina regenerativa.

Degradadas progressivamente por metaloproteinases⁴ - em especial pela colagenase - as membranas acelulares devem suportar um equilíbrio complexo entre resistência à degradação e promoção de crescimento celular a partir do leito receptor, com uma reciprocidade dinâmica favorecendo a neoformação tecidual e adequada deposição de colágeno, até que o local do reparo tenha cicatrizado adequadamente. Assim, além do aspecto básico da biocompatibilidade, avaliar o tempo de degradação do suporte tridimensional também é primordial, já que sua ocorrência muito precoce pode levar à falência da reparação, especialmente naquelas que demandam maior resistência mecânica, como na reconstrução da parede abdominal⁵.

Neste sentido, além das diferenças em relação à sua origem alogênica ou xenogênica, assim como a sua natureza biológica tecidual - derme, mucosa intestinal, pericárdio, etc. - aspectos relacionados aos processos de preparo e reticulação são descritos como fatores importantes no comportamento biológico das MECs. Estudos demonstram que a reticulação aumenta a durabilidade dos biomateriais implantados, conferindo assim uma capacidade maior de fornecer suporte adequado para os processos de remodelagem com o colágeno endógeno nas reparações de hérnias abdominais⁷.

Inúmeras publicações utilizam as análises histológicas como principal ferramenta para avaliação desses processos biológicos em diferentes biopróteses, mas em sua grande maioria em experimentação animal^8,9, com observações em humanos restritas a casos complicados de reoperações, na vigência de infecções e remoção dos implantes^10,11.

OBJETIVO

O objetivo desta publicação é relatar os achados histológicos observados em biópsias de membranas acelulares de pericárdio bovino, implantadas na reparação da parede abdominal.

MÉTODO

De uma série de 40 reparações de parede abdominal associadas a implante de membrana acelular de pericárdio bovino, 3 pacientes foram submetidas a revisão cirúrgica, a saber: 2 casos, secundários a hérnias incisionais, para correção de cicatriz hipertrófica aos 13 meses (Figura 1) e 22 meses de pós-operatório, e 1 caso, secundário a reconstrução pós-ressecção de endometrioma de parede, revisado aos 23 meses de pós-operatório para exploração de possível recidiva. Em todos os casos a evolução pós-operatória transcorreu sem qualquer complicação, com os exames clínicos e radiológicos não identificando problemas relativos às áreas implantadas, com sucesso das reparações, sendo as revisões por indicações não relacionadas aos implantes. As pacientes foram devidamente informadas, por termo de consentimento, que seriam feitas biópsias na área do implante no momento de eventual revisão cirúrgica.

Figura 1 - A: Paciente com hérnia incisional supraumbilical, com indicação de reparação associada a reforço de parede abdominal com membrana acelular de pericárdio bovino. B: Visão intraoperatória da correção realizada, com membrana em posição suprafascial após aproximação direta da musculatura. C: Pós-operatório de 13 meses, mostrando cicatriz hipertrófica supraumbilical e suprapúbica comprometendo o resultado estético. Na revisão cirúrgica dessa cicatriz pôde-se observar a área implantada, confirmando-se a ausência de recidiva da hérnia ou outras alterações, obtendo-se então 3 biópsias para análises histológicas.

Figura 1 - A: Paciente com hérnia incisional supraumbilical, com indicação de reparação associada a reforço de parede abdominal com membrana acelular de pericárdio bovino. B: Visão intraoperatória da correção realizada, com membrana em posição suprafascial após aproximação direta da musculatura. C: Pós-operatório de 13 meses, mostrando cicatriz hipertrófica supraumbilical e suprapúbica comprometendo o resultado estético. Na revisão cirúrgica dessa cicatriz pôde-se observar a área implantada, confirmando-se a ausência de recidiva da hérnia ou outras alterações, obtendo-se então 3 biópsias para análises histológicas.

Nas áreas correspondentes aos implantes prévios em situação pré-aponeurótica, feitos pelo mesmo cirurgião e identificados fotograficamente, foram colhidas 3 amostras em pontos distintos da região implantada, retirando-se as amostras da aponeurose muscular em toda sua espessura. Após fixação e inclusão em parafina, foram realizados cortes seriados de 5µm de espessura, sendo coradas 60 lâminas para cada paciente com Hematoxilina - Eosina, Tricrômio de Gomori e Picrosirius Red para as diferentes análises.

Análise morfométrica

As lâminas foram examinadas com microscópio ótico Nikon SI E200 Trinocular para as colorações habituais e com luz polarizada para Picrosirius Red, sendo as imagens digitalizadas com câmera Digilab™ jkc em resolução de 8MB. Além dos aspectos básicos referentes à biocompatibilidade do material e características da neoformação tecidual, foram analisados também os aspectos de absorção/degradação dos implantes e o processo de celularização e deposição de colágeno no leito receptor, quantificados por análise computadorizada pelo software ImageJ, específico para esse fim¹² .

Tendo como padrão a imagem histológica do pericárdio acelular “in natura” (Figura 2), nas lâminas coradas em HE foram quantificadas as porcentagens de membrana residual presente nos diferentes períodos. O pericárdio acelular ainda presente nas diferentes amostras foi identificado e delimitado manualmente por dois examinadores independentes, sendo a porcentagem correspondente calculada automaticamente pelo software.

Figura 2 - Aspecto histológico padrão da membrana de pericárdio bovino "in natura" após processo de acelularização, confirmada pela total ausência de núcleos celulares. Este padrão, digitalmente memorizado em pixels e coloração pelas ferramentas do software ImageJ, foi utilizado para identificar e quantificar fragmentos residuais das membranas implantadas nos diferentes períodos de pós-operatório. Coloração HE/ Aumento 100xx.

Figura 2 - Aspecto histológico padrão da membrana de pericárdio bovino "in natura" após processo de acelularização, confirmada pela total ausência de núcleos celulares. Este padrão, digitalmente memorizado em pixels e coloração pelas ferramentas do software ImageJ, foi utilizado para identificar e quantificar fragmentos residuais das membranas implantadas nos diferentes períodos de pós-operatório. Coloração HE/ Aumento 100xx.

Nas lâminas coradas com Picrosirius Red - específica para fibras colágenas - foi feita complementarmente a quantificação da dimensão fractal tecidual por análise digital¹³, utilizando-se também o software ImageJ, representando a fragmentação tecidual por método automático específico denominado “Box-Count /Binary - Outline”.

RESULTADOS

As análises histológicas demonstraram nitidamente a biocompatibilidade do material, com todas as amostras evidenciando neoformação tecidual em substituição às membranas implantadas, com importante deposição de colágeno e tecido celularizado de aspecto normal. Não foram observadas reações locais importantes, identificando-se alguns raros pontos focais isolados mostrando macrófagos em processo inflamatório de leve intensidade. Em todos os períodos analisados foi possível identificar a presença de fragmentos de tecido acelular correspondente à membrana original (Figura 3).

Utilizando-se o software ImageJ, os fragmentos residuais da membrana implantada foram quantificados em 40%±7% aos 13 meses, em 20%±6% aos 22 meses e em 17%±6% aos 23 meses de pós-operatório. Essa quantificação, analisada pelo teste t não pareado, foi estatisticamente significante entre as amostras de 13 meses e as mais tardias, sendo que não houve diferença estatística entre 22 e 23 meses (Gráfico 1).

Gráfico 1 - Representação em Box-Plot da quantificação e estatística por análise de variância das porcentagens de fragmentos residuais de membrana acelular de pericárdio nos diferentes períodos. As membranas residuais foram identificadas histologicamente nos períodos de 13, 22 e 23 meses de pós-operatório e suas respectivas porcentagens calculadas na ferramenta específica do software ImageJ. Houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras de 13 meses comparadas aos 22 e 23 meses (p<0,0001) e sem diferença na comparação entre 22 e 23 meses.

Gráfico 1 - Representação em Box-Plot da quantificação e estatística por análise de variância das porcentagens de fragmentos residuais de membrana acelular de pericárdio nos diferentes períodos. As membranas residuais foram identificadas histologicamente nos períodos de 13, 22 e 23 meses de pós-operatório e suas respectivas porcentagens calculadas na ferramenta específica do software ImageJ. Houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras de 13 meses comparadas aos 22 e 23 meses (p<0,0001) e sem diferença na comparação entre 22 e 23 meses.

Figura 3 - Cortes histológicos de biópsias das áreas correspondentes aos implantes de membranas acelulares de pericárdio bovino, nos períodos pós-operatórios de: A, 13 meses; B, 22 meses; C e D, 23 meses. Em todos os períodos observa-se tecido celularizado neoformado em substituição às membranas implantadas, demonstrando processo de reparação de boa qualidade e ausência de processos inflamatórios ou reação do tipo "corpo estranho". Em todas as amostras se observam fragmentos de tecido acelularizado residual da membrana implantada (setas pretas), quantificados em cerca de 40% aos 13 meses, 20% aos 22 meses e 17% aos 23 meses de pós-operatório. Em D, aos 23 meses de pós-operatório, observa-se deposição de neocolágeno com bom padrão de reparação cicatricial e tecido celularizado normal em substituição ao implante (setas vermelhas). A, B e C Coloração Hematoxilina-Eosina. Em D Tricrômio de Gomori. Aumento 40xx em B e D; Aumento 100xx em A e C.

Figura 3 - Cortes histológicos de biópsias das áreas correspondentes aos implantes de membranas acelulares de pericárdio bovino, nos períodos pós-operatórios de: A, 13 meses; B, 22 meses; C e D, 23 meses. Em todos os períodos observa-se tecido celularizado neoformado em substituição às membranas implantadas, demonstrando processo de reparação de boa qualidade e ausência de processos inflamatórios ou reação do tipo "corpo estranho". Em todas as amostras se observam fragmentos de tecido acelularizado residual da membrana implantada (setas pretas), quantificados em cerca de 40% aos 13 meses, 20% aos 22 meses e 17% aos 23 meses de pós-operatório. Em D, aos 23 meses de pós-operatório, observa-se deposição de neocolágeno com bom padrão de reparação cicatricial e tecido celularizado normal em substituição ao implante (setas vermelhas). A, B e C Coloração Hematoxilina-Eosina. Em D Tricrômio de Gomori. Aumento 40xx em B e D; Aumento 100xx em A e C.

Utilizando-se a coloração em Picrosirius com luz polarizada, foi feita a análise da dimensão fractal das lâminas nos diferentes períodos de pós-operatório, também se utilizando método automático em ferramenta específica do software ImageJ, demonstrado na Figura 4.

A distribuição dos valores da dimensão fractal de cada subgrupo, pelo gráfico de Box-Plot, mostra nítida separação de valores entre o subgrupo com menor tempo de seguimento (13 meses) e os subgrupos (juntos ou separados) com 22 e 23 meses de seguimento (Gráfico 2).

Gráfico 2 - Análise em Box-Plot da dimensão fractal das imagens histológicas do pericárdio bovino acelular nos diferentes períodos de pós-operatório, mostrando nítida separação de valores para as amostras de 13 meses e os subgrupos (juntos ou separados) de 22 e 23 meses, indicando diferença estatisticamente significativa na fragmentação progressiva dos implantes. Software ImageJ (Método Make Binary, Outline).

Gráfico 2 - Análise em Box-Plot da dimensão fractal das imagens histológicas do pericárdio bovino acelular nos diferentes períodos de pós-operatório, mostrando nítida separação de valores para as amostras de 13 meses e os subgrupos (juntos ou separados) de 22 e 23 meses, indicando diferença estatisticamente significativa na fragmentação progressiva dos implantes. Software ImageJ (Método Make Binary, Outline).

Figura 4 - Representação da análise automatizada da dimensão fractal pelo software ImageJ. Na coluna da esquerda, imagens digitalizadas de lâminas coradas em Picrosirius sob visão de luz polarizada, aos 13 e 23 meses de pós-operatório conforme indicado. À direita, a correspondente representação computadorizada para análise do grau de fragmentação estrutural, definida como dimensão fractal. As análises automáticas mostram um aumento estatisticamente significante da dimensão fractal nos casos mais tardios, indicando ocorrência progressiva de neoformação tecidual por processo de celularização e deposição de colágeno no leito receptor, corroborando os achados da cinética de degradação da membrana.

Figura 4 - Representação da análise automatizada da dimensão fractal pelo software ImageJ. Na coluna da esquerda, imagens digitalizadas de lâminas coradas em Picrosirius sob visão de luz polarizada, aos 13 e 23 meses de pós-operatório conforme indicado. À direita, a correspondente representação computadorizada para análise do grau de fragmentação estrutural, definida como dimensão fractal. As análises automáticas mostram um aumento estatisticamente significante da dimensão fractal nos casos mais tardios, indicando ocorrência progressiva de neoformação tecidual por processo de celularização e deposição de colágeno no leito receptor, corroborando os achados da cinética de degradação da membrana.

A análise por meio do teste t não pareado mostrou diferença estatisticamente significante ente 13 meses contra 22 meses (p=0,0058), entre 13 meses contra 23 meses (p=0,0128) e entre 13 meses contra o conjunto de 22 e 23 meses (p<0,0001), com o aumento da dimensão fractal indicando a ocorrência progressiva de neoformação tecidual por processo de celularização e deposição de colágeno no leito receptor. Não houve diferença estatisticamente significante na dimensão fractal comparando-se 22 meses contra 23 meses (p=0,3141).

Os dois métodos de avaliação morfométrica adotados tiveram achados concordantes, com redução da porcentagem de implante residual demonstrando sua progressiva absorção/degradação, concomitante à ocorrência de celularização e deposição de colágeno evidenciada pelo aumento progressivo da dimensão fractal.

DISCUSSÃO

O aumento exponencial da oferta de matrizes acelulares de diferentes origens nos últimos anos e as projeções de crescimento desse mercado¹⁴ comprovam a adoção crescente de biopróteses em diferentes opções terapêuticas, assim como na engenharia de tecidos¹⁵, como moldes para cultivo de células tronco¹⁶ e na aplicação de “drug delivery”¹⁷, com MECs embebidas em medicamentos com diferentes finalidades.

Seu diferencial como implante em diversos processos de reparação reside particularmente por suas características de biocompatibilidade, pela degradação/absorção progressiva dos implantes e por sua concomitante substituição por neoformação tecidual. Além disso, diferentemente dos implantes sintéticos, que podem induzir resposta inflamatória polímero-dependente com a formação de biofilmes^18,19, biopróteses acelulares exercem funções biológicas “in situ”, favorecendo os processos regenerativos^20,21, além de permitir sua aplicação em locais cirúrgicos contaminados e infectados^22,23.

As análises histológicas a partir de modelos experimentais constituem a principal ferramenta de avaliação desses processos biológicos, com centenas de publicações descrevendo diversos aspectos das matrizes extracelulares como origem tecidual, espessura, métodos de acelularização, reticulação, etc. - na tentativa de indicar as melhores escolhas para os diferentes processos de reparação. No presente estudo foi possível observar histologicamente os principais processos biológicos em humanos em condições de normalidade, uma condição incomum e com aspectos ainda não descritos na literatura para reparações em parede abdominal.

Nas áreas implantadas pôde-se observar a incorporação da MEC de pericárdio no leito receptor, com neovascularização e presença crescente de neotecido celularizado e adequada deposição de colágeno em todos os períodos analisados, com reparação de boa qualidade e ausência de processos inflamatórios ou sinais importantes de resposta imune. Além da excelente biocompatibilidade, isto demonstra que o material cumpriu sua função de “scaffold” biológico, favorecendo os processos de adesão, proliferação e diferenciação celular, servindo como substrato para reparo tecidual, característica fundamental esperada em estruturas biológicas compostas de matrizes extracelulares²⁴.

Achados similares com biopróteses acelulares implantadas em humanos para reconstruções mamárias foram relatados na literatura, com derme humana²⁵ e porcina^26,27, descrevendo o processo de integração das MECs como uma forma de cicatrização normal, com neovascularização inicial seguida de repopulação celular progressiva da matriz com células do receptor e ausência de reações tipo corpo estranho.

Com dados também ainda não encontrados na literatura, foi possível quantificar a cinética de degradação do pericárdio bovino acelular implantado na parede abdominal, analisados por dois métodos computadorizados complementares. Em todas as biópsias das áreas implantadas nos diferentes períodos foi possível identificar fragmentos padrão de pericárdio acelular residual, que foram quantificados percentualmente, complementados com a análise da dimensão fractal das amostras ao longo do tempo.

Ambas as análises indicaram que o processo de reabsorção e substituição por neotecido é progressivo, com diferença estatisticamente significante, observando-se que cerca de 60% do implante foi reabsorvido após 13 meses de pós-operatório e cerca de 80% após cerca de dois anos, sugerindo que toda matriz deverá ser degradada a longo prazo.

Outras publicações também descrevem a cinética de degradação em porcentagens de MEC residual ou absorvida para derme porcina e serosa intestinal, também com morfometria computadorizada, por análise multiespectral das imagens histológicas²⁸ ou com matrizes marcadas com Carbono-14²⁹. Os resultados mostram presença de membrana residual até 90 dias para matrizes de serosa intestinal não reticuladas, desaparecendo por volta de 180 dias e, para matizes dérmicas reticuladas, de reabsorção bem mais lenta, com presença de 80% do implante nas primeiras 4 semanas e 50% ainda presente por volta de 6 meses.

Como descrito na literatura^7,8,30, esse aspecto confirma a maior resistência à degradação da matriz reticulada utilizada, podendo representar uma vantagem para reparações nas quais se exige maior resistência mecânica a longo prazo como na parede abdominal. A funcionalidade de materiais degradáveis depende do balanço entre a razão de degradação e a razão de remodelamento tecidual no leito hospedeiro, devendo-se compreender não só a resposta biológica aos biomateriais degradáveis, mas também as propriedades mecânicas esperadas do implante e dos tecidos de substituição ao longo do tempo para cada aplicação terapêutica³¹.

Esses achados são compatíveis com diversos estudos clínicos e experimentais utilizando diferentes MECs em reparações de parede abdominal^32,33, incluindo também o pericárdio bovino³⁴, mostrando características muito satisfatórias para seu emprego mesmo em situações de alto risco³⁵. Numa análise comparativa com a vasta literatura apresentada, os resultados evidenciam o caráter translacional dos modelos experimentais utilizados para avaliação e caracterização de matrizes acelulares e demonstram a estreita similaridade do pericárdio utilizado com aquelas características gerais e aplicações terapêuticas. No entanto, inúmeras variáveis particulares podem afetar os resultados clínicos^36-38, destacando aqui para discussão aspectos específicos do leito receptor em si e da matriz utilizada em termos de acelularização, reticulação e sua apresentação em meio líquido.

A ação de forças biomecânicas atuando em diferentes localizações pode afetar diferencialmente a distribuição de colágeno e a remodelação tecidual dos moldes biológicos³⁹, sendo este um componente fundamental a ser considerado no emprego de MECs em parede abdominal⁴⁰. Os resultados obtidos demonstraram neoformação tecidual de boa qualidade em todas as amostras, atestando a funcionalidade do implante sob diferentes níveis de estresse mecânico na parede abdominal.

O pericárdio utilizado é fixado em glutaraldeído - técnica empregada eficazmente há décadas em matrizes acelulares⁴¹ - e embebido pós-fixação em formaldeído a 4%, sendo comercializado dessa forma. Além do glutaraldeído promover redução da antigenicidade do tecido conectivo e estabilização contra degradação química e enzimática em graus variados de “cross-linking”^42,43, esta associação tem efeitos bem descritos de esterilização terminal⁴⁴, importante fator que também pode afetar as propriedades estruturais de matrizes acelulares⁴⁵. Além de processamento mais simples, a manutenção em meio líquido é descrita como vantajosa para a arquitetura tecidual, evitando o colapso e preservando os componentes da matriz que fornecem benefícios mecânicos e bioquímicos após a implantação⁴⁶.

Embora a liofilização facilite a manipulação e preservação a longo prazo de MECs, fatores podem afetar sua performance tanto na sua síntese, com perturbações das fibras colágenas⁴⁷, como no momento de sua implantação, com o tempo de reidratação podendo alterar significativamente suas propriedades biomecânicas e físico-químicas⁴⁸. Podemos especular que também estes fatores favoreceram o comportamento da membrana empregada, tanto em função da sua biocompatibilidade como de sua cinética de degradação observada.

CONCLUSÕES

As análises histológicas demonstraram similaridade com todas as características biológicas descritas na literatura para matrizes acelulares teciduais, podendo-se observar nas amostras processo de integração e incorporação das MECs, com neovascularização seguida de repopulação celular progressiva da matriz com células do receptor e deposição de colágeno com boa qualidade cicatricial, demonstrada pelo aumento da dimensão fractal. Também com aspecto relevante em humanos, a cinética de degradação da matriz de pericárdio bovino foi quantificada em aproximadamente 60% após 13 meses e 80% após cerca de dois anos, sugerindo que toda matriz poderá ser degradada em prazo mais longo.

Sob ambos os aspectos, os resultados atestaram a funcionalidade do pericárdio bovino acelular sob diferentes níveis de estresse mecânico nas reparações da parede abdominal em humanos.